陳 瑞 楊志偉 朱鳳妹 齊鵬宇 李 響李 軍 張進(jìn)杰

(1河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島 066600；2秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北 秦皇島 066004)

牛奶以及奶粉是日常生活中普遍存在的食品，由于能供給機(jī)體營(yíng)養(yǎng)和能量而被廣泛食用。 牛奶及奶粉的生產(chǎn)原料來(lái)自于奶牛體內(nèi)，所以被歸類于動(dòng)物源性食品。 在飼養(yǎng)奶牛期間，使用獸藥的現(xiàn)象普遍存在，而我國(guó)超標(biāo)使用和濫用獸藥的現(xiàn)象非常嚴(yán)重，尤其是抗菌類的藥物[1]。 因此，對(duì)牛奶及奶粉獸藥殘留監(jiān)控已成為保障消費(fèi)者健康的重要方向[2]。 研究表明，苯并咪唑類藥物可廣譜抗菌、抗真菌，被廣泛用于農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和獸醫(yī)業(yè)[3]。 阿苯達(dá)唑(albendazole)[4]、芬苯達(dá)唑(fenbendazole)[5-6]、奧芬達(dá)唑(oxfendazole)[7]、噻苯達(dá)唑(tiabendazole)[8]、 苯硫氨酯(febantel)對(duì)于驅(qū)腸蟲(chóng)、線蟲(chóng)以及控制真菌有很大作用。 此類化合物可抑制細(xì)胞活性，影響生殖功能及胚胎發(fā)育等[9-10]；如果該類藥物進(jìn)入人體并在體內(nèi)蓄積，將會(huì)有潛在的致突變性和致畸性，危害人體健康[11-12]。所以有必要建立更快速、準(zhǔn)確和高靈敏度的檢測(cè)方法，以保證牛奶及奶粉的安全性。

多數(shù)國(guó)家已將苯并咪唑類藥物列為重要的監(jiān)測(cè)對(duì)象，并制定了最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[13]。 我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)布的235 號(hào)公告修訂了《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留的限量》，明確了乳及乳制品中苯并咪唑類藥物的殘留限量。 目前，檢測(cè)苯并咪唑類藥物的方法有液相色譜法[14-15]、液相色譜-質(zhì)譜法[16-18]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法[19]、熒光分析法[20]、免疫分析法[21]、氣相色譜-質(zhì)譜法[22]等。 液相色譜法靈敏度較高，能夠滿足篩選檢測(cè)需要，但缺乏結(jié)構(gòu)信息，不能作為確證依據(jù)；毛細(xì)管電泳法測(cè)定樣品耗時(shí)較長(zhǎng)；免疫分析方法質(zhì)量難以控制；氣相色譜-質(zhì)譜法由于苯并咪唑類藥物難以氣化，需衍生后測(cè)定；而高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法相對(duì)其他方法，定性定量更準(zhǔn)確、檢測(cè)限更低，特異性強(qiáng)。 本試驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶及奶粉中5 種苯并咪唑類藥物殘留量，液液萃取結(jié)合Prime HLB 固相萃取凈化技術(shù)，旨在建立更高效、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。 同時(shí)，本研究擬對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 22972-2008》[23]中所提出的方法進(jìn)行優(yōu)化，簡(jiǎn)化試驗(yàn)過(guò)程，提高效率以及靈敏度，進(jìn)而為牛奶及奶粉中阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、噻苯達(dá)唑和苯硫氨酯的快速檢測(cè)提供新方法，為奶制品生產(chǎn)企業(yè)及相關(guān)執(zhí)法部門(mén)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A、B、C 3 種品牌袋裝牛奶和奶粉，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

甲酸、乙腈均為色譜純，德國(guó)Merck 公司；氯化鈉(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；阿苯達(dá)唑(純度≥98%)、芬苯達(dá)唑(純度≥99%)、奧芬達(dá)唑(純度≥98.5%)、噻苯達(dá)唑(純度≥98%)、苯硫氨酯(純度≥98%)標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Witega 公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Nexera UHPLC LC-30A 超高液相色譜儀，日本島津公司；AB SCIEX 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)QTRAP ? 6500，美國(guó)AB SCIEX 公司；Prime HLB 固相萃取柱(200 mg·6 mL-1)，美國(guó)Waters 公司；TURBOVAPLV 氮?dú)庑鳚饪s儀、VOATEX-2 渦旋混合器，瑞典Biotage 公司；Milli-Q? Gradient 超純水凈化器，美國(guó)Millipore 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg 阿苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、噻苯達(dá)唑、苯硫氨酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容至50 mL，0～4℃冷藏備用。

1.3.2 樣品預(yù)處理

1.3.2.1 牛奶樣品 準(zhǔn)確稱取2 g 牛奶于離心管中，加入15 mL 提取液，振蕩10 min 后，加入0. 5 g無(wú)水氯化鈉，繼續(xù)振蕩5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取出10 mL 上清液。 為防止對(duì)5 種藥物的提取不充分，在殘?jiān)屑尤?0 mL 乙腈進(jìn)行二次提取，重復(fù)上述操作，合并上清液，混勻，待凈化。

1.3.2.2 奶粉樣品 準(zhǔn)確稱取1 g 奶粉，加入7 g 水溶解混勻，取1 g 溶解液，按照1.3.2.1 步驟操作。

1.3.3 樣品凈化 用6 mL 乙腈活化固相萃取柱后，凈化上清液，接收流出液，40℃條件下氮吹至近干，用1 mL 20%乙腈水溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm 濾膜，待測(cè)。

1.3.4 色譜-質(zhì)譜條件 色譜柱:Acquity UPLC?BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫為30℃；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B 為乙腈；進(jìn)樣量為10 μL；色譜梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution programme in the HPLC analysis

離子源:電噴霧離子源(ESI)；掃描方式:正離子掃描(ESI+)；檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)；離子源溫度:500℃；電噴霧電壓:5 500 V；霧化氣壓力:345 kPa；輔助氣壓力:345 kPa；氣簾氣壓力:172 kPa；其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

1.3.5 方法優(yōu)化

1.3.5.1 提取液的選擇 分別比較將甲醇與乙腈作為提取液時(shí)沉淀蛋白的效果。

1.3.5.2 固相萃取柱的選擇 比較HLB、Prime HLB兩類固相萃取柱以及兩種不同規(guī)格(60 mg·3 mL-1和200 mg·6 mL-1)的Prime HLB 固相萃取柱對(duì)牛奶及奶粉的凈化效果，對(duì)含同一濃度藥物的樣品平行測(cè)定4次，將每種藥物測(cè)定的平均峰面積與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。

1.3.5.3 濃縮方法的選擇 試驗(yàn)對(duì)比了不同溫度下，旋蒸法及氮吹法對(duì)回收率的影響，對(duì)不同濃縮方法進(jìn)行考察，選擇合適的方法。

1.3.6 方法學(xué)考察

1.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限 以陰性樣品(牛奶、奶粉)為空白基質(zhì)，分別配制質(zhì)量濃度在1 ～500 μg·L-1范圍內(nèi)的一系列5 種苯并咪唑類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)，按照優(yōu)化后的方法及儀器條件進(jìn)行分析，以5 種待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。 以3 倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得到牛奶及奶粉中5 種苯并咪唑類藥物的檢出限。

1.3.6.2 添加回收及精密度試驗(yàn) 按照優(yōu)化后的方法分別做添加濃度為1、2、5、10 μg·kg-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)及基質(zhì)空白。 每個(gè)濃度平行測(cè)定4 次。

1.3.6.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 按照優(yōu)化后的方法做若干空白基質(zhì)，配制濃度在1～500 μg·L-1范圍內(nèi)不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。

按照公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)[24]:ME=[1-(牛奶及奶粉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)]×100%。

表2 5 種苯并咪唑類藥物的串聯(lián)質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Tandem mass spectrometry parameters of five kinds of benzimidazole

若ME 為負(fù)值，則牛奶及奶粉基質(zhì)對(duì)信號(hào)有增強(qiáng)作用，相反則有抑制作用[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

以10 μL·min-1針泵優(yōu)化，分別將濃度為50 μg·L-1的5 種苯并咪唑類藥物進(jìn)行質(zhì)譜一級(jí)全段掃描，確定其母離子。 再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描得到碎片離子并進(jìn)行條件的優(yōu)化。 一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)表3。 按照歐盟標(biāo)準(zhǔn)[26]，選擇1 個(gè)母離子和2 個(gè)子離子，并依據(jù)子離子豐度比對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性定量分析。 本試驗(yàn)采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式檢測(cè)。

2.2 色譜條件的選擇

5 種苯并咪唑類藥物總離子流及定量離子MRM 見(jiàn)圖1。 結(jié)果顯示，采用Acquity UPLC? BEH C18為色譜柱，用0.1%甲酸水溶液與乙腈進(jìn)行梯度洗脫，可以達(dá)到良好的分離效果。 通過(guò)對(duì)洗脫條件的優(yōu)化，調(diào)節(jié)有機(jī)相與水相的比例后，4.38～6.35 min 內(nèi)所有的目標(biāo)物均出峰，可在10 min 左右完成一個(gè)樣品的分析，其分離體系效果優(yōu)越，峰形良好且極大提高了分析速度。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取液的選擇 牛奶和奶粉中蛋白質(zhì)含量較高，如果樣品中的蛋白等雜質(zhì)未除凈，會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。 前處理可以選擇一定濃度的酸堿溶液、重金屬鹽溶液或有機(jī)溶劑作為除蛋白的提取液。 但以酸堿溶液或重金屬鹽溶液作為提取液時(shí)，需要溶液交換有機(jī)溶劑，步驟繁瑣。 本試驗(yàn)在GB/T 22972-2008[23]的基礎(chǔ)上，比較了甲醇、乙腈的提取效果。 通過(guò)觀察樣品中蛋白質(zhì)的沉淀現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)甲醇所沉淀的蛋白質(zhì)較少，乙腈較多，對(duì)比李琴等[27]用乙腈沉淀生鮮乳中的蛋白，陳娟等[28]用乙腈沉淀蛋白提取牛奶中的磺胺類藥物的方法，最終選擇乙腈作為本試驗(yàn)的提取液。

2.3.2 固相萃取柱的選擇 Prime HLB 是一種新型的反向固相萃取柱，能選擇性地吸附牛奶中的磷脂等非極性干擾物而不吸附目標(biāo)藥物，可除去蛋白、鹽和磷脂等基質(zhì)干擾物[29-30]。 由圖2 可知，200 mg·6mL-1Prime HLB 固相萃取柱的凈化效果優(yōu)于200 mg·6mL-1HLB。 Prime HLB 固相萃取柱有不同規(guī)格，故測(cè)試對(duì)比了60 mg·3mL-1、200 mg·6mL-1固相萃取柱的效果，發(fā)現(xiàn)規(guī)格大的柱子效果好。 因此，后續(xù)試驗(yàn)采用200 mg·6mL-1Prime HLB 固相萃取柱作為凈化柱。

2.3.3 溫度及濃縮方法對(duì)回收率的影響 試驗(yàn)最初使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃條件下蒸干25 mL 流出液，5種待測(cè)物的回收率(75%～82%之間)相對(duì)較低，故改用在40℃條件下蒸干流出液，回收率提高(89%～98%之間)，猜測(cè)原因可能是溫度(50℃)太高導(dǎo)致待測(cè)物不穩(wěn)定。 但是在40℃蒸干流出液時(shí)，多次偶有某種待測(cè)物回收率不穩(wěn)定的現(xiàn)象，分析可能是人為因素導(dǎo)致的，因?yàn)樵谕慌蔚臉悠氛舾蓵r(shí)，出現(xiàn)了溫度、轉(zhuǎn)速條件不穩(wěn)定的現(xiàn)象，導(dǎo)致回收率不穩(wěn)定。 后改進(jìn)試驗(yàn)方案，使用40 mL 氮吹管在40℃條件下吹干25 mL 流出液，使得流出液處于同一且穩(wěn)定的溫度下吹干。 多次試驗(yàn)結(jié)果顯示該條件下回收率穩(wěn)定(表5)，故選擇40℃氮吹作為濃縮條件。

表3 5 種苯并咪唑類藥物的結(jié)構(gòu)式及一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜圖Table 3 Structural，primary and secondary spectra of five kinds of benzimidazole

圖3 為陰性樣品譜圖。 結(jié)果表明該樣品中不含有5 種苯并咪唑類藥物，可將其作為空白基質(zhì)。 在前處理最優(yōu)化條件下，圖4 是在陰性牛奶和奶粉樣品添加5 種苯并咪唑類藥物后按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行前處理并分析后得到的譜圖。 結(jié)果表明，5 種苯并咪唑類藥物峰形及分離度均良好，說(shuō)明本試驗(yàn)制定的試驗(yàn)步驟去除雜質(zhì)效果好且對(duì)藥物無(wú)明顯干擾。

圖1 5 種苯并咪唑類藥物總離子流及定量離子MRM 結(jié)果Fig.1 Total ion current and quantitative ion MRM of five kinds of benzimidazole

表4 牛奶和奶粉中5 種苯并咪唑類藥物線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 kinds of benzimidazole in milk and milk powder

圖2 不同固相萃取柱凈化效果的比較Fig.2 Comparison of purification effects of different solid phase extraction columns

圖3 陰性牛奶和奶粉樣品譜圖Fig.3 Chromatograms of negative milk and milk powder

圖4 牛奶和奶粉樣品添加譜圖Fig.4 Addition chromatograms of milk and milk powder

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 牛奶與奶粉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)方程及檢出限和定量限 由表4 可知，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r均大于0.996，說(shuō)明在1 ～500 μg·L-1范圍內(nèi)5 種苯并咪唑類藥物的質(zhì)量濃度和峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.2 回收率及精密度 在提取時(shí)共使用25 mL 乙腈，只取上清液20 mL，為保持濃度一致，故基質(zhì)空白管在定容前按照0.8 的倍數(shù)添加5 種苯并咪唑類藥物的混標(biāo)，20%乙腈水溶液定容至1 mL，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)與樣品添加同時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定回收率。 每個(gè)濃度平行測(cè)定4次，其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deciation，RSD)見(jiàn)表5。 5 種藥物的平均回收率介于91.7%～97.8%之間，且RSD 在1.4%～6.5%范圍內(nèi)，取得了良好的試驗(yàn)結(jié)果。

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng) 由表6 可知，ME 均為正值，所以牛奶及奶粉基質(zhì)對(duì)5 種苯并咪唑類藥物的質(zhì)譜信號(hào)均呈抑制作用，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)微弱。

表5 牛奶及奶粉中5 種苯并咪唑類藥物加標(biāo)回收率及RSD(n＝4)Table 5 Scaling recovery and RSD of 5 kinds of benzimidazole in milk and milk powder (n＝4) /%

表6 牛奶及奶粉的基質(zhì)效應(yīng)Table 6 The matrix effects of milk and milk powder

2.5 樣品的實(shí)際測(cè)定

按照上述最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，市購(gòu)的3 種品牌的牛奶及奶粉中均未檢出5 種苯并咪唑類藥物。

3 討論

本研究主要對(duì)國(guó)標(biāo)《GB/T 22972-2008》[23]中的樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化。 《GB/T 22972 -2008》[23]前處理使用乙腈、正丙醇提取5 種苯并咪唑類藥物，C18固相萃取柱凈化，而本研究利用乙腈提取后直接采用Prime HLB 固相萃取柱凈化，通過(guò)對(duì)比所耗時(shí)間，前者預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4 h，本研究將時(shí)間縮短至1 h。 《GB/T 22972-2008》[23]在前處理過(guò)程當(dāng)中，加入正丙醇后40℃旋蒸，而正丙醇的沸點(diǎn)為97.4℃，為提高工作效率，本研究省去了此步驟。 《GB/T 22972-2008》[23]中5 種藥物的平均回收率介于70.8%～93.6%之間；曾艷兵等[21]選用乙酸乙酯提取，Oasis HLB 固相萃取小柱凈化后，5 種藥物的平均回收率介于60.3%～90.9%之間，本研究利用乙腈提取后直接采用Prime HLB 固相萃取柱凈化，液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定5 種藥物的回收率介于91.7%～97.8%之間，回收率明顯提高，符合殘留檢測(cè)要求。 表明不同前處理方法，尤其是提取和凈化條件，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大[31]。 《GB/T 22972-2008》[23]中5 種藥物的檢出限分別為10 μg·kg-1(牛奶)和80 μg·kg-1(奶粉)，本研究中5 種藥物的檢出限處于0.1 ～3.0 μg·kg-1范圍內(nèi)，但陳瑩等[32]利用乙酸乙酯提取，Oasis HLB 固相萃取小柱凈化動(dòng)物組織后，苯并咪唑類藥物的檢出限為0.1 ～0.5 μg·kg-1，結(jié)果與本研究有差異，推測(cè)可能由于基質(zhì)成分的不同或前處理方法具有針對(duì)性，導(dǎo)致靈敏度和檢出限不同，如不同種類的固相萃取柱對(duì)除油脂、蛋白質(zhì)、糖分等其他雜質(zhì)具有不同的效果。 因此，后續(xù)研究可針對(duì)不同基質(zhì)的特性，篩選最優(yōu)的凈化條件，進(jìn)一步降低該類藥物的檢出限，為相關(guān)檢測(cè)技術(shù)部門(mén)提供技術(shù)支持。

本研究結(jié)果表明，在市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買的3 種品牌牛奶及奶粉中均未檢測(cè)到以上5 種苯并咪唑類藥物。 推測(cè)其原因，在奶牛飼養(yǎng)過(guò)程中該類藥物早期使用或未使用，且原料的選擇經(jīng)過(guò)一定的周期，藥物隨著生理活動(dòng)排出體外，未造成體內(nèi)殘留。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)前處理包括提取、凈化方式及色譜條件的優(yōu)化，建立了固相萃取結(jié)合超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶及奶粉中5 種苯并咪唑類藥物分析方法。 該方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、基質(zhì)效應(yīng)不明顯，能夠滿足牛奶和奶粉中5 種苯并咪唑類藥物的檢測(cè)要求，同時(shí)在樣品前處理以及儀器條件上有了較大改進(jìn)，突出了Prime HLB 固相萃取凈化技術(shù)的重要性及可行性，展現(xiàn)了儀器條件的先進(jìn)性，并獲得了良好的試驗(yàn)結(jié)果，可為檢測(cè)牛奶和奶粉中的獸藥殘留提供檢測(cè)技術(shù)支持。