董 燁 張益奇 姚洪正 何光喜 戴志遠(yuǎn)

(1浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035； 3海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116000；4杭州千島湖發(fā)展集團(tuán)有限公司，浙江 杭州 311701)

鳙魚(yú)(Aristichthys nobilis)俗稱(chēng)胖頭魚(yú)，是我國(guó)主要淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，其繁殖速度快，產(chǎn)量大。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國(guó)鳙魚(yú)產(chǎn)量達(dá)309.6 萬(wàn)t[1]。 鳙魚(yú)頭肥而味美，富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。 但鳙魚(yú)頭的暢銷(xiāo)不可避免地導(dǎo)致魚(yú)骨、魚(yú)鱗、魚(yú)皮等下腳料亟待處理。 魚(yú)骨作為魚(yú)頭、魚(yú)片加工過(guò)程的主要副產(chǎn)物之一，其膠原蛋白及鈣含量豐富，而目前國(guó)內(nèi)對(duì)于魚(yú)骨的綜合利用技術(shù)比較滯后，大多只是被用作動(dòng)物飼料或直接丟棄，利用率低，尋找合適的處理方法提高魚(yú)骨的利用價(jià)值，對(duì)我國(guó)水產(chǎn)品加工行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

目前，魚(yú)骨的處理方法主要有酸堿法[3-5]、酶解法[6-8]和高壓蒸煮法[9-11]等。 但酸堿法處理通常會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，而且在連續(xù)的加工步驟中操作困難，得率低、耗時(shí)長(zhǎng)[12]，限制了魚(yú)骨的有效利用；酶解法雖然溫和可控，但魚(yú)骨內(nèi)部的膠原蛋白是由3 條螺旋鏈相互纏繞而成的螺旋結(jié)構(gòu)，其基質(zhì)附著羥基磷灰石，使得魚(yú)骨非常堅(jiān)固，難以被有效酶解[13]；高壓蒸煮法雖然可以提高酶解效率，但其所需時(shí)間較長(zhǎng)，效率較低，而且可能導(dǎo)致一些熱敏性氨基酸損失[14]。 因此開(kāi)發(fā)一種環(huán)境友好、簡(jiǎn)便的魚(yú)骨預(yù)處理方法具有重要的研究意義。 近年來(lái)，汽爆技術(shù)[15]作為一種先進(jìn)的物理化學(xué)預(yù)處理技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注，其原理是將高壓蒸汽壓入物料內(nèi)部空隙，保壓一段時(shí)間后，瞬間泄壓，容器內(nèi)蒸汽通過(guò)膨脹對(duì)外做功，產(chǎn)生沖擊波對(duì)物料進(jìn)行機(jī)械剪切，使得物料組分間緊密結(jié)構(gòu)破壞、解離。 該技術(shù)相比于傳統(tǒng)的高壓蒸煮法具有短時(shí)、高效、能耗低的優(yōu)勢(shì)。

本試驗(yàn)以鳙魚(yú)骨為研究對(duì)象，經(jīng)汽爆處理后，采用堿性蛋白酶酶解，以水解度、蛋白質(zhì)回收率、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)可溶性氮得率為指標(biāo)，研究不同汽爆處理?xiàng)l件對(duì)鳙魚(yú)魚(yú)骨酶解特性的影響，進(jìn)一步探究魚(yú)骨酶解產(chǎn)物分子量的分布情況，旨在建立一種簡(jiǎn)單高效環(huán)保的預(yù)處理方法，為高效利用水產(chǎn)加工副產(chǎn)物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚(yú)魚(yú)骨，購(gòu)自杭州千島湖；堿性蛋白酶Alcalase 3.0 T，丹麥諾維信公司中國(guó)天津分公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；碳酸酐酶(29 000 Da)、細(xì)胞色素C(12 400 Da)、抑肽酶(6 500 Da)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-histidyl-leucine，HHL)(429 Da)等，均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QBS 200B 汽爆機(jī)，正道生物能源公司；e2695 高效液相色譜，美國(guó)Waters 公司；400Y 多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；DGG-9123A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；K-360 凱氏定氮儀、K-425 快速消解儀，瑞士Buchi 公司；DSHZ-300A 旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚(yú)骨原料的前處理 將新鮮魚(yú)骨用清水沖洗后瀝干，用0.1 mol·L-1NaOH 溶液浸泡4 h，每2 h 換一次溶液，除去雜蛋白，流水沖至中性，瀝干備用。

1.3.2 汽爆處理工藝 將汽爆機(jī)預(yù)熱至所需壓力，取200 g 經(jīng)1.3.1 處理的魚(yú)骨置于汽爆機(jī)內(nèi)，保壓一定時(shí)間后瞬間泄壓，將樣品噴至接收器中，完全收集汽爆后的樣品于40℃烘干，粉碎后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 汽爆處理單因素及酶解試驗(yàn) 保壓時(shí)間的影響:在汽爆壓力0.6 MPa、酶解溫度50℃、酶添加量2.0%、酶解時(shí)間3 h、初始pH 值8.0 條件下，設(shè)定保壓時(shí)間為0、0.5、1.0、2.0、3.0 min。

汽爆壓力的影響:在酶解溫度50℃、酶底比2.0%、酶解時(shí)間3 h、初始pH 值8.0，保壓時(shí)間3.0 min 條件下，設(shè)定汽爆壓力為0、0.3、0.6、1.0 MPa。

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.0%的魚(yú)骨溶液，按酶底比1 ∶50加堿性蛋白酶，pH 值調(diào)至8.0 后，于恒溫振蕩水浴鍋中50℃恒溫酶解3.0 h。 將酶解液于沸水浴中滅酶10 min，8 000 r·min-1離心15 min，取上清液過(guò)濾備用。

1.3.4 水解度的測(cè)定 水解度采用甲醛滴定法[16]測(cè)定。

1.3.5 蛋白質(zhì)回收率的測(cè)定 采用BCA 試劑盒測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)濃度，原料中的蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定。 按照公式計(jì)算蛋白質(zhì)回收率:

1.3.6 TCA 可溶性氮得率的測(cè)定 將20%TCA 與酶解液等體積比混合，然后于4℃靜置1 h，3 000×g離心10 min，采用BCA 試劑盒測(cè)定上清液可溶性蛋白含量。 按照公式計(jì)算TCA 可溶性氮得率:

1.3.7 酶解液分子量分布 參照涂丹等[17]的方法。色譜條件為:TSKgel G2000 SWxl(7.8 mm×300 mm，Tosoh)色譜柱，Waters e2695 HPLC 系統(tǒng)和UV/Vis 檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流動(dòng)相為乙腈45%-水溶液(0.1% TFA)55%，流速0.5 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，時(shí)間40 min。 相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為:HHL(429 Da)、抑肽酶(6 500 Da)、細(xì)胞色素C(12 400 Da)、碳酸酐酶(29 000 Da)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，采用多重比較分析法對(duì)各組進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P＜0.05)，用Origin Pro 2018 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 汽爆處理對(duì)魚(yú)骨蛋白質(zhì)回收率的影響

由圖1 可知，蛋白質(zhì)回收率隨汽爆壓力和保壓時(shí)間的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)汽爆壓力為0.6 MPa，保壓時(shí)間為2.0 min 時(shí)達(dá)到32.69%，而未處理組僅為7.92%，差異顯著(P＜0.05)，這可能是由于汽爆作用下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏展[18-19]，降解為更多小分子物質(zhì)，低分子物質(zhì)溶出，回收率增加。 而當(dāng)保壓時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，汽爆壓力進(jìn)一步增大，蛋白質(zhì)回收率反而下降，這可能是由于當(dāng)汽爆壓力過(guò)高，保壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成了可溶性蛋白的損失，魚(yú)骨蛋白過(guò)度水解，從而導(dǎo)致了回收率下降。

2.2 汽爆處理對(duì)TCA 可溶性氮得率的影響

TCA 可以沉淀十肽以上的蛋白質(zhì)[20]，采用TCA可溶性氮得率可表征酶解液的短肽得率。 由圖2 可知，當(dāng)汽爆壓力為0.6 MPa，保壓時(shí)間為2.0 min 時(shí)TCA 可溶性氮得率為28.79%，較未處理組高出22.75%(P＜0.05)；維持保壓時(shí)間為3.0 min，當(dāng)汽爆壓力進(jìn)一步增大時(shí)，TCA 可溶性氮得率反而呈下降趨勢(shì)，但是仍較未處理組高出一倍，可見(jiàn)汽爆處理對(duì)于魚(yú)骨蛋白的提取具有顯著影響，這與蛋白質(zhì)回收率的趨勢(shì)一致。

2.3 汽爆處理對(duì)魚(yú)骨水解度的影響

圖1 汽爆處理對(duì)魚(yú)骨蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.1 Effect of steam explosion treatment on protein recovery of fish bone

圖2 汽爆處理對(duì)魚(yú)骨酶解液TCA 可溶性氮得率的影響Fig.2 Effect of steam explosion treatment on the soluble nitrogen in fish bone enzymatic hydrolysate

由圖3 可知，在保壓時(shí)間為3.0 min 條件下，魚(yú)骨水解度隨著汽爆壓力的增大逐漸增大(P＜0.05)，這可能是因?yàn)殡S著汽爆壓力的增大，在高溫高壓的協(xié)同作用下，部分蛋白質(zhì)直接降解為小分子物質(zhì)，魚(yú)骨蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出更多酶切位點(diǎn)，蛋白質(zhì)肽鍵不斷斷裂，魚(yú)骨水解度逐漸增大。 在汽爆壓力為0.6 MPa 條件下，保壓時(shí)間為0.5～2.0 min 時(shí)，魚(yú)骨水解度隨保壓時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸增大的趨勢(shì)，在保壓時(shí)間為2.0 min 時(shí)達(dá)到8.69%，而未處理組僅為3.45%，差異顯著(P＜0.05)，但隨著保壓時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)其水解度變化不顯著(P＞0.05)。

2.4 魚(yú)骨酶解液相對(duì)分子質(zhì)量分布

以各標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)[lg(M)]為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 由圖4 可知，lg(M)與t呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為:lg(M)=-0.209t+6.992，決定系數(shù)R2=0.991 3。 根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品相對(duì)分子質(zhì)量的分布情況。 圖5 為魚(yú)骨經(jīng)汽爆壓力0.6 MPa、保壓時(shí)間2.0 min 汽爆處理后的酶解液相對(duì)分子量分布情況。 結(jié)果表明，經(jīng)堿性蛋白酶酶解3.0 h 后基本不存在大分子，1 000 Da 以下的小分子占93%。 表明經(jīng)汽爆預(yù)處理后，鳙魚(yú)骨蛋白酶解較徹底，酶解效果較好。

3 討論

圖3 汽爆處理對(duì)魚(yú)骨水解度的影響Fig.3 Effect of steam explosion treatment on the degree of hydrolysis of fish bone

圖4 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of relative molecular mass

圖5 魚(yú)骨酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布色譜圖Fig.5 Chromatogram of relative molecular mass distribution of fish bone hydrolysate

近年來(lái)，酶法制備生物活性肽受到廣泛關(guān)注[21]。魚(yú)骨中蛋白分子通過(guò)氫鍵、疏水作用等次級(jí)鍵形成致密的纖維狀結(jié)構(gòu)，使得酶催化位點(diǎn)被包埋，阻礙了蛋白酶水解。 此外，魚(yú)骨組分中灰分含量較高，主要以羥基磷灰石形式存在，這些抗性屏障使得魚(yú)骨難以被降解。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)適當(dāng)?shù)母邷馗邏禾幚砜梢云茐牡鞍踪|(zhì)分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)剛性結(jié)構(gòu)軟化，處于解離狀態(tài)[22-23]，提高酶解效率。 如朱文慧等[24]采用超高壓耦合酶解技術(shù)處理鱈魚(yú)骨發(fā)現(xiàn)，超高壓酶解液中可溶性肽含量是常壓酶解液中的1.47 倍。 胡靜等[25]將金槍魚(yú)骨于121℃蒸煮30 min 后，采用響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝，得到酶解產(chǎn)物水解度為12.34%。 吳克剛等[26]發(fā)現(xiàn)當(dāng)蒸煮壓力為0.13 MPa、蒸煮時(shí)間為75 min 時(shí)，羅非魚(yú)骨的軟化效果最好。 高壓蒸煮處理在一定程度上有利于魚(yú)骨破碎，使蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，提高蛋白質(zhì)的溶出率，但用時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)。

汽爆技術(shù)作為一種綠色、高效的物理化學(xué)處理方法，已廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)原料的預(yù)處理，并取得了較好的效果。 汽爆技術(shù)整合了高溫高壓蒸煮產(chǎn)生的熱能以及瞬間泄壓產(chǎn)生的機(jī)械能，使得物料組分間緊密結(jié)構(gòu)被破壞、解離，極大地縮短了預(yù)處理時(shí)間。 但將汽爆技術(shù)用于魚(yú)骨蛋白提取的研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。 本研究采用汽爆技術(shù)軟化魚(yú)骨，使魚(yú)骨部分蛋白質(zhì)溶出，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏展，更易于被酶切。 本研究表明，當(dāng)汽爆壓力為0.6 MPa，保壓時(shí)間為2.0 min 時(shí)，TCA 可溶性氮得率和蛋白質(zhì)回收率分別是未處理組的4.76 倍和4.12倍，汽爆預(yù)處理可顯著提高魚(yú)骨蛋白的酶解特性。 相比于前人研究，本研究預(yù)處理時(shí)間更短，操作工藝更簡(jiǎn)便，能耗更低，極大地提升了效率。 Tan 等[27]將鱈魚(yú)骨于121℃處理90 min，采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，得到2 種酶解產(chǎn)物中主要肽的分子量在1 000 ～3 000 Da 之間，1 000 Da 以下的肽分別占23.83%和29.63%。 Fan 等[28]將狹鱈骨架于121℃處理30 min，采用堿性蛋白酶酶解，得到酶解產(chǎn)物相對(duì)分子量在1 000 Da 以下的占29.34%。 本試驗(yàn)所制得的鳙魚(yú)骨酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量在200 ～1 000 Da 之間的占93%，相比于前人研究，分子量較小，分布更集中。

本研究利用汽爆技術(shù)處理魚(yú)骨，在高溫蒸汽和機(jī)械剪切力作用下，一方面利于魚(yú)骨內(nèi)部蛋白質(zhì)從羥基磷灰石等抗性屏障溶出，另一方面適度熱處理可使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，尤其是使膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)變得松散，暴露出更多酶切位點(diǎn)，更易于被酶切，有效釋放內(nèi)部活性肽段，在較短的酶解時(shí)間內(nèi)達(dá)到較好的酶解效果。 本試驗(yàn)初步研究了汽爆處理對(duì)鳙魚(yú)骨蛋白酶解特性的影響，但對(duì)魚(yú)骨汽爆處理最優(yōu)工藝參數(shù)，以及汽爆魚(yú)骨蛋白的構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)汽爆處理能顯著提高魚(yú)骨蛋白溶出率和降解程度。 當(dāng)汽爆壓力為0.6 MPa，保壓時(shí)間為2.0 min 時(shí)，蛋白質(zhì)回收率為32.69%，TCA 可溶性氮得率為28.79%，是未處理組的4～5 倍，此時(shí)魚(yú)骨水解度為8.69%，酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在1 000 Da以下，高達(dá)93%。 本研究只針對(duì)汽爆處理對(duì)魚(yú)骨酶解特性進(jìn)行了初步探究，后續(xù)可從產(chǎn)業(yè)需求出發(fā)，有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)具有抗氧化性、抗凍性、抗菌性等功能特性的魚(yú)骨水解液，進(jìn)一步拓寬魚(yú)骨蛋白資源用途。 汽爆作為一種物理化學(xué)預(yù)處理技術(shù)，具有綠色環(huán)保、短時(shí)高效等優(yōu)勢(shì)，為水產(chǎn)加工副產(chǎn)物中豐富的蛋白質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用提供了一條新途徑。