龔芳芳 王 曄 陳淑敏 張玉琦 劉英丹 孟天宇 婁永江 李勇勇

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315832)

龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)是我國重要的海洋經(jīng)濟(jì)藻類之一，因其營養(yǎng)豐富，美味且富含膳食纖維等特點(diǎn)而備受人們的喜愛[1]。 硼的本底值是龍須菜安全監(jiān)控的重要指標(biāo)之一，據(jù)報(bào)道，近年來，我國龍須菜中硼的本底值已呈現(xiàn)逐年升高的趨勢[2]。 硼是海洋中浮游植物等生物生長所必需的微量元素，而且海洋藻類是已知富集硼的有機(jī)體，每年平均有4.4×1010kg 硼被海洋有機(jī)體攝取[3]。 硼在參與細(xì)胞壁的構(gòu)建時(shí)，首先經(jīng)過植物的細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并被植物吸收利用[4]。 因此，細(xì)胞壁作為植物抵御外界污染物以及重金屬毒害的第一道屏障發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。Matoh 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高于80%的硼與煙草愈傷細(xì)胞壁中的果膠多糖結(jié)合。 楊玉華等[7]研究認(rèn)為油菜體內(nèi)硼的結(jié)合位點(diǎn)主要集中于細(xì)胞壁。

植物細(xì)胞壁由糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)構(gòu)成，其中多糖組分在初生細(xì)胞壁中占主導(dǎo)地位[8]。 龍須菜細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、海藻膠(瓊膠)、蛋白質(zhì)等成分組成[9]。 細(xì)胞壁多糖中富含的各種負(fù)電基團(tuán)(羥基、羧基、氨基等)可通過化學(xué)、物理等吸附方式將金屬陽離子固著于細(xì)胞壁上，進(jìn)而在一定程度上避免了游離重金屬對細(xì)胞壁內(nèi)敏感細(xì)胞的干擾和毒害[10-11]。 可見，多糖類物質(zhì)在維持細(xì)胞壁功能方面不可或缺。 研究發(fā)現(xiàn)，硼脅迫后，植物細(xì)胞壁組分如半纖維素、果膠等含量明顯上升[12]，其對硼的富集能力也隨之顯著增強(qiáng)。 而細(xì)胞壁結(jié)合二價(jià)陽離子的能力與多糖含量及所富含官能團(tuán)如羧基、羥基和巰基的數(shù)量呈正相關(guān)[13]。目前關(guān)于龍須菜中硼的研究仍處于探究硼分布的初步階段，研究表明龍須菜吸附的硼多集中在細(xì)胞壁。 而關(guān)于龍須菜細(xì)胞壁多糖組分，如海藻膠(瓊膠)、纖維素、半纖維素在其對硼的吸附固定過程中所起到的作用，以及各細(xì)胞壁多糖組分中哪些官能團(tuán)在硼吸附固定過程中起到關(guān)鍵性作用等一系列問題尚未解決。 因此，本試驗(yàn)以褐藻龍須菜為研究對象，通過吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)和傅立葉紅外光譜(fourier transform infrared，F(xiàn)TIR)技術(shù)材料表征，探究龍須菜吸附硼的行為特征，揭示龍須菜細(xì)胞壁組分吸收累積硼的內(nèi)在機(jī)理，以期為藻類對硼毒害的適應(yīng)性及耐性分子機(jī)制的研究提供新的思路和研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍須菜采自福建省福州市馬尾區(qū)。 選取高度在15～25 cm 之間，長勢均一的鮮樣龍須菜，經(jīng)超純水迅速?zèng)_洗后，備用。

液氮購自寧波海曙東贏氣體有限公司；乙醇、丙酮、甲醇、氯仿、苯酚、KOH、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈣、硫酸均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硼酸溶液、α-淀粉酶，購自寧波甬川生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HX-10-50DG 臺式壓蓋多歧管冷凍干燥機(jī)，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；FK-DG300 電感耦合等離子發(fā)射光譜，美國PE 公司；H-2050R 離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)有限公司；FTIR-4600 傅立葉變換紅外光譜儀，中世沃克科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞壁的提取及硼含量的測定 參照Zhong等[14]的方法并做適當(dāng)修改，通過細(xì)胞破碎的方式抽提細(xì)胞壁。 新鮮龍須菜吸取適量水分后倒入研缽中，研磨過程中加入液氮直至龍須菜呈粉末狀，然后轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，加入75%冰乙醇浸提20 min，5 000 r·min-1離心10 min，去上清液后，采用冰丙酮溶液浸提30 min，再離心10 min 去上清。 按同樣操作步驟，再依次加入甲醇∶氯仿(體積比為1 ∶1)、甲醇提取。 去上清液后，將沉淀用30 mL 乙酸/苯酚/水的溶液(體積比為1 ∶2 ∶1)超聲輔助浸提30 min(25℃、200 W)，5 000 r·min-1離心10 min，以去除蛋白質(zhì)、酚類等物質(zhì)，反復(fù)洗提3 次(浸提試劑用量均為10 mL·g-1，以樣品鮮重計(jì))。 再用α-淀粉酶去除淀粉多糖后(37℃、3 h)，用20 mL 超純水沖洗殘留在細(xì)胞表面雜物，重復(fù)3 次，所得沉淀即為細(xì)胞壁多糖粗品，冷凍干燥后密封保存(4℃)，標(biāo)記為GW-A。

細(xì)胞壁經(jīng)0.02 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉解析40 min，解析3 次，去除樣品中本底硼，樣品標(biāo)記為GWA1。 GW-A1外源硼脅迫后標(biāo)記為GW-A2。 準(zhǔn)確稱取GW-A、GW-A1和GW-A2樣品于消解罐中，同時(shí)加5 mL 濃硝酸進(jìn)行消解。 待消解完成后，用超純水定容至25 mL，再經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，采用電感耦合等離子光譜法(inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy，ICP-AES)測定各樣品組分的硼含量。

1.3.2 細(xì)胞壁多糖組分的分離 參照朱琳等[15]的方法并做適當(dāng)修改。 稱取2 g 干燥的細(xì)胞壁(GW-A)樣品，加入160 mL 超純水，沸水浴2 h，然后5 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)操作3 次，上清液為瓊膠提取組分，冷凍干燥后稱重備用；沉淀用去超純水重復(fù)沖洗3 次，冷凍干燥后，4℃保存得去瓊膠樣品GW-B。樣品GW-B 脫硼步驟參照1.3.1，硼脫除后樣品標(biāo)記為GW-B1。 GW-B1外源硼脅迫后標(biāo)為GW-B2。 各組分硼測定方法同1.3.1。

結(jié)合Hoson 等[16]的方法，取樣品GW-B 粉末置于離心管中，加入20 mL KOH 溶液(4 mol·L-1)浸提6 h，浸提3 次，上清液為半纖維素。 沉淀經(jīng)離心分離后采用超純水快速淋洗3 次，冷凍干燥后，稱重，4℃保存?zhèn)溆?，?biāo)記為GW-C。 樣品GW-C 脫硼步驟參照1.3.1，硼脫除后標(biāo)記為GW-C1。 GW-C1外源硼脅迫后標(biāo)為GW-C2。 各組分硼測定方法同1.3.1。

1.3.3 細(xì)胞壁多糖組分的測定 參照Dubios[17]的方法，苯酚硫酸比色法以葡萄糖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。 采用苯二酚比色法測定細(xì)胞壁糖醛酸[18]。

1.4 龍須菜細(xì)胞壁硼吸附的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

吸附溶液為5 mg·L-1的 H3BO3溶液，0.02 mol·L-1CaCl2溶液作為支持電解液(pH 值5.75)。 將0.02 g 龍須菜細(xì)胞壁各組分(GW-A、GW-B、GW-C)置于底部墊有濾紙的一次性注射器中，注射器上方裝置有滴定管(100 mL)用于盛放吸附溶液，其針頭部位接連一次性輸液器(流速2 mL·min-1)用于控制流速。用離心管收集流出液后采用ICP-OES 測定流出液中硼離子的濃度，當(dāng)流出液中硼離子濃度與吸附溶液中硼離子濃度相同時(shí)，吸附即達(dá)到飽和。 試驗(yàn)重復(fù)4 次，取平均值做吸附曲線。

1.5 不同處理細(xì)胞壁表面官能團(tuán)表征

將光譜純溴化鉀與樣品混勻壓片，按1 ∶120 的比例加入，于研缽中充分研磨。 同等條件下測定不同處理細(xì)胞壁樣品在4 000～500 cm-1波數(shù)內(nèi)的FTIR 圖。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用Excel 2013 和Origin 9.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞壁多糖組分及硼含量的測定結(jié)果

龍須菜細(xì)胞壁中多糖組分主要由瓊膠、半纖維素、纖維素3 種成分組成。 由表1 可知，細(xì)胞壁中纖維素含量較高，約為40.27%，其次為瓊膠(35.21%)、半纖維素(24.49%)。 硼多與瓊膠結(jié)合，測得瓊膠中硼含量為51.25 mg·kg-1，纖維素、半纖維素中硼含量分別為27.55、20.80 mg·kg-1。 硼脫除試驗(yàn)中，細(xì)胞壁(GWA)、細(xì)胞壁去瓊膠(GW-B)和細(xì)胞壁去瓊膠去半纖維素(GW-C)3 個(gè)組分的硼脫除率高達(dá)97.61%，這為進(jìn)一步探究硼與細(xì)胞壁多糖組分各官能團(tuán)的交互作用奠定了基礎(chǔ)。

表1 細(xì)胞壁多糖含量和硼本底值Table 1 Cell wall polysaccharide content and boron background value

2.2 細(xì)胞壁多糖對硼的吸附試驗(yàn)結(jié)果

由圖1 可知，龍須菜細(xì)胞壁總吸附量約100 mg·kg-1，細(xì)胞壁各組分在前100 min 內(nèi)，吸附速率呈現(xiàn)快速增長的趨勢，隨后吸附速率明顯減慢，在350 min 后達(dá)到平衡。 吸附平衡后，去瓊膠后即GW-B 比GW-A 硼吸附量相對降低了50.13%，可知瓊膠的吸附量為50.13%。 去半纖維素后即GW-C 比GW-B 硼吸附量相對降低21.20%，可知半纖維素的吸附量為21.20%。 而28.67%的硼吸附在纖維素上。 結(jié)果表明細(xì)胞壁及多糖組分在吸附過程中硼吸附量與其本底硼含量相差甚少，說明各組分的官能團(tuán)充分暴露，吸附達(dá)到飽和。

圖1 龍須菜細(xì)胞壁不同組分對硼的吸附曲線Fig.1 Adsorption curve of boron for different components of Gracilaria lemaneiformis cell wall

2.3 不同細(xì)胞壁組分的紅外光譜分析

參照文獻(xiàn)[19]對龍須菜細(xì)胞壁各組分(GW-A、GW-B、GW-C)的紅外光譜圖(圖2)進(jìn)行解析，得到細(xì)胞壁多糖組分主要官能團(tuán)變化的信息(表2)。

通過對龍須菜細(xì)胞壁的紅外光譜(圖2)進(jìn)行解析，得到對照組即龍須菜細(xì)胞壁的特征峰，在3 431 cm-1處為氨基(-NH)、羥基(-OH)伸縮振動(dòng)重合峰(NO.1)；2 928 cm-1處的峰可能是甲基(-CH3)的對稱伸縮振動(dòng)峰(NO.2)；1 643 cm-1和1 512 cm-1處的2 個(gè)強(qiáng)吸收峰對應(yīng)酰胺Ⅰ帶(NO.3)和酰胺Ⅱ帶(NO.4)，源于細(xì)胞壁中殘留的蛋白質(zhì)對譜峰(NO.5)的貢獻(xiàn)，推測含有少量蛋白質(zhì)與瓊膠或纖維素形成糖蛋白復(fù)合物。 1 258 cm-1處的吸收峰(NO.6)可能是羧基的CO、硫酸酯的C-O-S 或磷酸鹽的特征吸收峰；1 057 cm-1處的吸收峰歸屬為纖維素多糖鏈中的C-C 伸縮振動(dòng)(NO.7)。

圖2 細(xì)胞壁改性前后紅外光譜表征Fig.2 Infrared spectroscopy characterization before and after cell wall modification

采用傅里葉紅外光譜對龍須菜細(xì)胞壁及各組分進(jìn)行半定量分析，每個(gè)譜圖分別以2 928 cm-1處-CH3中C-H 特征吸收峰的吸光度(A2928)為標(biāo)準(zhǔn)值，利用其他特征峰處的吸光度A 與A2928的比值變化間接半定量分析官能團(tuán)含量的差異[20]，分析結(jié)果如表2 所示。 根據(jù)A/A2928比值得出，在龍須菜GW-A 組分中，羥基和氨基官能團(tuán)數(shù)目較多，羧基、纖維素多糖鏈CC 次之。 與GW-A 相比，GW-B、GW-C 的A3431/A2928和A1258/A2928比值依次遞減，表明龍須菜細(xì)胞壁多糖組分即瓊膠、半纖維素、纖維素均被一定量的羥基、羧基基團(tuán)覆蓋。 其中，羥基大量分布在纖維素中，而在瓊膠、半纖維素2 個(gè)組分中含量相當(dāng)；半纖維素中羧基含量較多。

表2 龍須菜細(xì)胞壁不同多糖組分及相應(yīng)官能團(tuán)Table 2 Different polysaccharide components and corresponding functional groups in the cell wall of Gracilaria lemaneiformis

2.4 硼脅迫前后細(xì)胞壁各組分的紅外光譜分析

龍須菜細(xì)胞壁組分固定硼時(shí)，官能團(tuán)特征吸收峰位移發(fā)生偏移則說明其參與了硼的吸附；反之則不吸附或吸附能力弱。 因此，可以通過吸收峰位移變化的程度來判斷參與硼結(jié)合的官能團(tuán)。 前人也得到類似的研究成果，如周冉[21]研究表明番茄細(xì)胞壁果膠在累積Cd2+過程中，官能團(tuán)吸收峰位移偏離程度代表著對Cd2+的吸附能力；韓潤平等[22]比較了谷殼在Pb2+脅迫前后羥基特征峰變化，結(jié)果表明羥基基團(tuán)上的氫因被Pb2+取代而向高頻移動(dòng)。

圖3 細(xì)胞壁脫硼及硼脅迫后紅外光譜圖比較Fig.3 Comparison of infrared spectra after deboration and boron stress of cell wall

圖4 細(xì)胞壁去瓊膠脫硼及硼脅迫后的紅外光譜圖比較Fig.4 Comparison of infrared spectra of dephosphorization and boron stress in cell wall degumming agar

細(xì)胞壁及各組分對照組和硼脅迫組紅外譜圖如圖3～5 和表3 所示。 硼脅迫組GW-A2的羥基伸縮振動(dòng)峰與對照組GW-A1相比向高頻位移動(dòng)了15 cm-1，GW-B2、GW-C2向高頻分別移動(dòng)了9、2 cm-1。 硼脅迫組GW-A2和GW-B2羧基伸縮振動(dòng)峰向高頻移動(dòng)了10、3 cm-1，而GW-C2向低頻移動(dòng)1 cm-1。 羥基、羧基吸收峰遷移位移的縮減表明隨著瓊膠、半纖維素的去除，其吸附作用相應(yīng)減弱。 GW-A2、GW-B2、GW-C2羧酸鹽COO-分別向高頻方向移動(dòng)了13、25、20 cm-1，表明隨著瓊膠及半纖維的去除，羧酸鹽COO-的不對稱伸縮振動(dòng)作用逐漸凸顯。 多糖鏈C-C 在硼脅迫后，其作用也明顯增強(qiáng)，其中，GW-B2向低頻移動(dòng)了5 cm-1，GW-C2向高頻移動(dòng)13 cm-1，說明多糖鏈C-C 在細(xì)胞壁去瓊膠去半纖維后，成為纖維素中與硼結(jié)合的主要位點(diǎn)之一。 蛋白質(zhì)特征峰酰胺Ⅰ帶(-C-N)和酰胺Ⅱ帶(-N-N)未表現(xiàn)出對硼的吸收，可忽略不計(jì)，即細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組分的硼本底值低于ICP-OES 最小檢出限。 綜上所述，瓊膠、半纖維素中的羥基、羧基是硼的主要結(jié)合位點(diǎn)，而纖維素中起主要官能團(tuán)作用的是多糖鏈C-C 和羧酸鹽COO-。

表3 龍須菜細(xì)胞壁多糖硼脅迫前后前后FTIR 光譜表征Table 3 FTIR spectroscopic characterization of different polysaccharide components in the cell wall of gracilaria lemaneiformis

圖5 細(xì)胞壁去瓊膠去半纖維素脫硼及硼脅迫紅外光譜圖比較Fig.5 Comparison of infrared spectrum of decellularization and boron stress of cell wall degummed agarose

3 討論

對龍須菜細(xì)胞壁各個(gè)多糖組分紅外光譜譜圖進(jìn)行半定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)龍須菜細(xì)胞壁中含量最高的為羥基、氨基，其次為多糖鏈C-C、羧基。 對比各多糖組分所含的官能團(tuán)差異，羥基大量存在于纖維素中，羧基在瓊膠中含量較多。 半纖維素中多糖鏈C-C 含量最高。 多糖的3 個(gè)組分中均含有一定量的羥基、氨基、羧基。 由此可見，瓊膠、半纖維素和纖維素均有吸附硼的潛力。

龍須菜細(xì)胞壁多糖組分主要由瓊膠、半纖維素、纖維素3 種成分組成。 海洋藻類龍須菜作為瓊膠的提取原料，其細(xì)胞壁的瓊膠含量約35%。 硼的吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，硼(50.13%)主要與細(xì)胞壁中的瓊膠組分結(jié)合，其次是纖維素及半纖維素。 研究發(fā)現(xiàn)在油菜體內(nèi)，細(xì)胞壁是硼的主要結(jié)合位點(diǎn)，尤其是細(xì)胞壁中的果膠成分[23]。 同時(shí)，Zheng 等[24]也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁中的果膠可以與陽離子共價(jià)結(jié)合。 目前，相關(guān)陸生植物中果膠與硼離子結(jié)合機(jī)制的研究較多，藻類植物中富含大量的海藻膠(瓊膠)，其對硼的吸附機(jī)制與果膠類似。研究表明，細(xì)胞壁結(jié)合金屬離子的能力與官能團(tuán)羧基、羥基和巰基的多糖數(shù)量呈正相關(guān)[13]。 比較硼吸附前后GW-A1、GW-A2紅外光譜圖可知，瓊膠多糖的羧基、羥基官能團(tuán)對硼具有一定吸附能力。 這可能是因?yàn)榄偰z中的瓊膠酯含有較多負(fù)電基團(tuán)，負(fù)電荷的多糖單元靠靜電引力與金屬離子相結(jié)合，如羥基、羧基、醛基、氨基等能結(jié)合多種陽離子[25-26]。 瓊膠雖為中性糖，但其內(nèi)含的糖醛酸、藻酸鹽等成分可以溶解、絡(luò)和金屬離子[27-28]。 其中藻酸鹽主要由2 種酸性單糖1，4-β-D-甘露糖醛酸(mannuronic acid，MA)及α-L 古羅糖醛酸(guluronicacid，GA)無序排列的線性縮合高聚物組成，它們分別提供單基配位和多基配位體[27，29]。 然而，不同植物中胞外多糖組成不同，與硼的結(jié)合機(jī)制也存在一定的差異。 由此推測瓊膠中的半乳吡喃糖也是結(jié)合硼離子的主要成分之一。 有研究表明，半纖維素中的阿拉伯木聚糖鏈上富含的葡萄糖殘基結(jié)構(gòu)使其帶一定的負(fù)電荷[30]，易與陽離子結(jié)合。 同時(shí)半纖維素還包括了較多高分子多糖，如多縮阿拉伯糖、多縮甘露糖和多縮半乳糖醛酸等[31]。 在硼脅迫下，這些高分子多糖富含的羥基和羧基等官能團(tuán)可以與硼離子迅速結(jié)合。 此外，瓊膠中富含各種多糖聚合物[32-33]，很可能與半纖維爭奪硼的結(jié)合位點(diǎn)。 隨著瓊膠的去除，半纖維素上的官能團(tuán)充分暴露，使得半纖維可以結(jié)合更多的硼。進(jìn)而推測細(xì)胞壁中硼主要通過靜電、離子絡(luò)合等化學(xué)吸附作用與瓊膠以及半纖維素結(jié)合。

由吸附硼前后的GW-C1和GW-C2的紅外光譜圖可知，纖維素雖然富含羥基、羧基等有機(jī)基團(tuán)，但這些官能團(tuán)對硼離子的紅外吸收峰遷移并不明顯。 而GW-C(纖維素)吸附硼的過程中纖維素多糖鏈C-C、羧酸鹽COO-不對稱振動(dòng)的紅外吸收峰向高頻遷移位移較大。 究其原因，可能是因?yàn)槔w維素是一種由D-葡萄糖殘基通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的直鏈多糖[5]，多糖結(jié)構(gòu)上的大量羥基基團(tuán)極可能將分子鏈間和分子內(nèi)部的氫鍵包裹，即掩蓋了纖維素的活化吸附作用[34]。 另一方面也可能是因?yàn)槔w維素自身的還原性使得多糖鏈C-C 斷裂生成二醛和酸，可與一定量的硼螯合[35]。 纖維素因表面積大和含有大量的微孔結(jié)構(gòu)，使其對金屬離子具有良好的吸附性能[36]，而其吸附Cu2+、Pb2+、Cd2+等金屬陽離子的過程是由顆粒擴(kuò)散和化學(xué)反應(yīng)共同控制[32]。 因此，硼不僅可以通過絡(luò)合作用，而且可通過范德華力和靜電引力等物理吸附作用與纖維素緊密結(jié)合在一起。

4 結(jié)論

綜上所述，龍須菜細(xì)胞壁及多糖組分對硼具有較高吸附力，其與硼的結(jié)合方式主要是以離子絡(luò)合及物理吸附為主。 其中瓊膠、半纖維素主要以化學(xué)吸附為主，纖維素中物理和化學(xué)吸附兩者并存。 龍須菜細(xì)胞壁吸附動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，各組分在350 min 基本達(dá)到吸附飽和，飽和吸附量為100 mg·kg-1。 硼主要與瓊膠、半纖維素中的羥基、羧基，纖維素的多糖鏈C-C 相互作用。 各多糖組分吸附量分別為:瓊膠(50.13%)、纖維素(28.67%)、半纖維素(21.20%)。 本研究為進(jìn)一步探究藻類細(xì)胞壁多糖成分與硼結(jié)合機(jī)制的研究提供了新的思路和方法。