羅 潔 王鴻飛 許 鳳 王 靖 池宗豫 謝柯沁 吳承豪 邵興鋒

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211)

柑橘(Citrus reticulataBlanco) 為柑橘亞科(subfamily Aurantioideae)柑橘屬(CitrusL.)植物，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，兼具藥用價(jià)值。 柑橘果實(shí)在采后貯運(yùn)期，由意大利青霉菌(Penicillium italicum)引起的采后青霉病較為常見(jiàn)，且在冷藏條件下更具危害性，可直接侵染健康果實(shí)[1]，導(dǎo)致果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)迅速下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。 目前，控制柑橘采后病害主要采用化學(xué)殺菌劑，如咪鮮胺、苯基苯酚、抑霉唑等，在柑橘上得到了廣泛應(yīng)用，然而殺菌劑殘留物會(huì)對(duì)人體健康以及環(huán)境構(gòu)成潛在的風(fēng)險(xiǎn)。 費(fèi)菜(Sedum aizoonL.)為景天科(crassulaceae)多年生野生草本植物，富含黃酮、多酚、多糖等功效成分[4]，具有抑菌活性，其作為植物源抑菌劑在天然保鮮防腐劑開(kāi)發(fā)方面前景廣闊。

黃酮(flavonoids)是一類(lèi)通常由2 個(gè)具酚羥基的苯環(huán)通過(guò)中央三碳原子相互連接而成的低分子量植物次生代謝產(chǎn)物[5]。 大量研究表明黃酮類(lèi)化合物通過(guò)影響細(xì)胞膜功能發(fā)揮抑菌機(jī)制[6]。 Peralta 等[7]發(fā)現(xiàn)高濃度(200～1 000 μmol·L-1)異戊二烯類(lèi)黃酮[2′，4′-dihydroxy-5′-( 1?，1?-dimethylallyl ) 8-prenylpino cembrin，8PP]處理的生物膜表現(xiàn)出不同的擴(kuò)散距離，改變了其表面結(jié)構(gòu)、空隙、通道和孔隙，進(jìn)而影響了生物膜基質(zhì)內(nèi)部的流動(dòng)性。 Tsuchiya 等[8]研究表明，槐屬二氫黃G( 5，7，2′，4′-tetrahydroxy-8-lavandulylflavanone，sophoraflavanone G)主要通過(guò)降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)如酶、蛋白質(zhì)、離子和核苷酸等成分的泄漏。 此外，也有植物源黃酮作用于菌體細(xì)胞膜達(dá)到抑菌效果的相關(guān)報(bào)道，如高良姜可以通過(guò)損傷金黃色葡萄球菌細(xì)胞質(zhì)膜，致使其鉀離子滲漏，造成細(xì)胞壁的滲透溶解或菌體的自我分解；蜂膠中的槲皮素可以增加細(xì)菌內(nèi)膜的通透性，致使膜電位發(fā)生改變，從而增強(qiáng)其抑菌活性[9]。

前期研究表明，費(fèi)菜黃酮通過(guò)膜損傷機(jī)制對(duì)豬肉腐敗菌乳酸菌發(fā)揮抑菌作用[10]，對(duì)食源性致病菌大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等均具有抑制效果[11]。 費(fèi)菜黃酮對(duì)柑橘類(lèi)水果致病菌的抑菌作用尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究從體外和體內(nèi)兩方面探討費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉的抑制作用及其機(jī)制，以期為柑橘的防腐保鮮提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

費(fèi)菜采自寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)基地，自然晾曬，60℃烘至水分含量小于5%后粉碎，過(guò)80 目篩，得費(fèi)菜干粉；柑橘于2018年10-11月期間采摘自寧波市秋歌生態(tài)農(nóng)場(chǎng)橘園，挑選大小均勻、色澤統(tǒng)一、成熟度一致、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害果實(shí)，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；意大利青霉(P. italicum)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所提供，4℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體(potatodextrose agar，PDA)培養(yǎng)基斜面保存。

PDA 培養(yǎng)基、馬鈴薯肉湯(potato dextrose broth，PDB)培養(yǎng)基，均購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司；H2O2測(cè)定試劑盒(比色法)，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國(guó)藥分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DNP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；B204LEDR 生物顯微鏡，重慶光學(xué)分析儀器廠；Biofugestratos 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Thermo Scienific SORVALL 公司；Cary50Scan 紫外分光光度計(jì)，美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司；S-3400N 型掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 費(fèi)菜黃酮的制備與測(cè)定 采用乙醇超聲波輔助提取法[12]。 取適量費(fèi)菜干粉，用90%乙醇按1 ∶40(w ∶v)料液比混合，超聲波輔助提取50 min(功率400 W，溫度60℃)，之后60℃水浴浸提2 h，室溫抽濾，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后加入2 倍體積無(wú)水乙醇于4℃靜置過(guò)夜，除去多糖；經(jīng)AB-8 大孔樹(shù)脂純化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后于-40℃冷凍干燥72 h 制成粉末；取適量粉末用30%乙醇溶解，采用AlCl3比色法測(cè)定總黃酮含量。

1.3.2 孢子懸浮液的制備 將意大利青霉接種至PDA 培養(yǎng)基上，于28±1℃培養(yǎng)7 d 進(jìn)行活化。 用無(wú)菌生理鹽水(0.9%)沖洗平板洗下孢子，8 層無(wú)菌紗布過(guò)濾去除營(yíng)養(yǎng)菌絲體，收集孢子懸浮液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度約為106spores·mL-1。

1.3.3 最低抑菌濃度 ( minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度( minimum fungicidal concentration，MFC)的測(cè)定 采取倍半稀釋法[13]制成費(fèi)菜黃酮終濃度為0.22、0.44、0.87、1.75、3.50、7.00、14.00 和28.00 mg·mL-1的含藥PDA 平板，以不含費(fèi)菜黃酮的平板為空白對(duì)照，接種20 μL 濃度約為106spores·mL-1的孢子懸浮液，均勻涂布。 28±1℃恒溫培養(yǎng)48 h 后觀察，以完全沒(méi)有菌絲生長(zhǎng)的最低濃度作為MIC；測(cè)出MIC 后，將MIC 下的PDA 平板繼續(xù)于28℃培養(yǎng)7 d，觀察菌絲的生長(zhǎng)情況，以無(wú)菌絲生長(zhǎng)的濃度作為MFC。

1.3.4 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉的抑菌活性 參考Wang 等[14]的方法，將濃度分別為0、0.87、1.75、3.50、7.00 mg·mL-1的費(fèi)菜黃酮與103spores·mL-1孢子懸浮液混合，于28±1℃培養(yǎng)16 h 后，將費(fèi)菜黃酮和孢子的混合物倒入PDA 平板涂布均勻，培養(yǎng)72 h 后計(jì)菌落數(shù)，按照公式計(jì)算分子孢子存活率:

1.3.5 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 采用瓊脂稀釋培養(yǎng)法[15]，將費(fèi)菜黃酮加至PDA 培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為0.44、0.87、1.75、3.50、7.00、14.00 和28.00 mg·mL-1，以不加費(fèi)菜黃酮作為空白對(duì)照。 取1 mL 106spores·mL-1孢子懸浮液至PDA 培養(yǎng)基上，涂布均勻后于28±1℃培養(yǎng)5 d，以備制作菌餅，打孔器打取菌餅(6 mm×6 mm)后反貼至含藥平板中央，于28±1℃培養(yǎng)。 采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并根據(jù)公式計(jì)算抑菌率:

1.3.6 細(xì)胞膜通透性的測(cè)定 參考Yang 等[16]的方法，將濃度為106spores·mL-1孢子懸浮液接種于PDB培養(yǎng)基中，于28℃、135 r·min-1恒溫回轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)48 h，稱(chēng)取1 g(濕重)菌絲加入費(fèi)菜黃酮使其終濃度為1 MIC，對(duì)照加入等量無(wú)菌水。 于培養(yǎng)后0、3、6、9、12 h分別取樣測(cè)定胞外電導(dǎo)率P1，無(wú)菌絲體的離子導(dǎo)電性為電導(dǎo)率本底值P0；菌絲煮沸10 min 冷卻后測(cè)定總電導(dǎo)率Pk。 按照公式計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率:

式中，P1為菌絲胞外電導(dǎo)率；Pk為總電導(dǎo)率；P0為電導(dǎo)率本底值。

1.3.7 細(xì)胞成分釋放的測(cè)定 將濃度為106spores·mL-1的意大利青霉孢子懸浮液加入PDB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h 后加入費(fèi)菜黃酮，使其終濃度為1 MIC，對(duì)照組加入等量無(wú)菌水，于28℃、135 r·min-1搖培，12 000 r·min-1離心收集上清液。 采用蒽酮法[17-18]測(cè)定菌懸液的總糖含量。

1.3.8 菌絲丙二醛(malondialdehyde，MDA)和H2O2含量的測(cè)定 菌絲培養(yǎng)及處理方法如1.3.6，收集處理后的菌絲，使用H2O2試劑盒測(cè)定菌絲H2O2含量。 參考Xu 等[19]的方法測(cè)定菌絲MDA 含量，計(jì)算公式如下:

式中，Vt為提取液總體積，mL；Vs為測(cè)定用提取液體積，mL；W 為樣品重量，g。

1.3.9 意大利青霉菌絲表面形態(tài)的觀察 從生長(zhǎng)7 d的菌落中洗脫孢子懸液，接種至50 mL 液體培養(yǎng)基中，于28±1℃，120 r·min-1搖培2 d。 然后參考Wallace等[20]的方法，分別經(jīng)1 MIC 和1 MFC 費(fèi)菜黃酮處理12 h，以正常生長(zhǎng)的菌絲作為對(duì)照。 收集菌絲球，置于3.0%戊二醛中4℃、pH 值7.2 條件下固定過(guò)夜，經(jīng)0.1 mol·L-1磷酸 鹽緩沖 液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗、乙醇梯度脫水、叔丁醇置換，冷凍干燥、粘樣、噴金后，于掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)下觀察并拍照。

1.3.10 發(fā)病率和病斑直徑的測(cè)定 果實(shí)用清水清洗干凈、晾干，用75%乙醇擦拭果皮，自然晾干。 用無(wú)菌槍頭在果實(shí)赤道部位形成大小統(tǒng)一的傷口(直徑3 mm，深度4 mm)，并注入20 μL 濃度分別為0(對(duì)照組)、0.3、0.6、1.2 mg·mL-1的費(fèi)菜黃酮，自然晾干后于傷口處接種104spores·mL-1孢子懸浮液10 μL，待其晾干后放入塑料保鮮盒中。 于25±1℃、相對(duì)濕度85%條件下培養(yǎng)5 d，發(fā)病后每隔1 d 測(cè)量柑橘果實(shí)的病斑直徑，統(tǒng)計(jì)果實(shí)的發(fā)病率。 每個(gè)處理27 個(gè)果實(shí)，重復(fù)2次。 采用十字交叉法測(cè)定果實(shí)病斑直徑，取平均值；果實(shí)病斑直徑≥0.50 cm 確定為發(fā)病。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SAS 8.1 軟件的Duncan′s multiple-range test進(jìn)行多重比較，采用Origin 9.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析并制圖。 未經(jīng)說(shuō)明，試驗(yàn)重復(fù)3 次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度和最小殺菌濃度的確定

由表1 可知，費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉有較好的抑制作用，培養(yǎng)2 d 時(shí)，當(dāng)費(fèi)菜黃酮濃度≥1.75 mg·mL-1時(shí)；未見(jiàn)明顯的菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉的MIC 為1.75 mg·mL-1；而培養(yǎng)7 d 時(shí)，當(dāng)費(fèi)菜黃酮濃度≥7.00 mg·mL-1時(shí)，未見(jiàn)明顯菌落，說(shuō)明費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉的MFC 為7.00 mg·mL-1。

表1 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉的MIC 和MFCTable 1 The MIC and MFC of flavonoids from Sedum aizoon L. on P. italicum

2.2 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉的抑菌活性

由圖1 可知，費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉有較好的抑制效果，當(dāng)費(fèi)菜黃酮濃度為0.87、1.75、3.50、7.00 mg·mL-1時(shí)，意大利青霉菌的存活率均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；當(dāng)費(fèi)菜黃酮濃度達(dá)到7.00 mg·mL-1，意大利青霉的可見(jiàn)菌落百分比為0。

2.3 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉菌絲生長(zhǎng)的影響

費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉的體外抑菌效果如表2 所示，隨著費(fèi)菜黃酮濃度的增加，抑菌效果也隨之增強(qiáng)，呈較好的劑量效應(yīng)關(guān)系；當(dāng)費(fèi)菜黃酮濃度為0.44 mg·mL-1時(shí)，菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到60.53%，當(dāng)費(fèi)菜黃酮濃度達(dá)到3.50 mg·mL-1時(shí)，抑菌率增加至84.91%。培養(yǎng)2 d 時(shí)，當(dāng)費(fèi)菜黃酮含量大于1.75 mg·mL-1時(shí)，菌絲基本未生長(zhǎng)，也說(shuō)明了費(fèi)菜黃酮的最小抑菌濃度為1.75 mg·mL-1；培養(yǎng)4 d 時(shí)，7.00 mg·mL-1費(fèi)菜黃酮能完全抑制意大利青霉菌絲體生長(zhǎng)，且費(fèi)菜黃酮濃度介于0.44～3.50 mg·mL-1時(shí)也對(duì)意大利青霉菌有不同程度的抑制作用。

2.4 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉細(xì)胞膜通透性的影響

由圖2 可知，經(jīng)1.75 mg·mL-1(1 MIC)費(fèi)菜黃酮處理后，意大利青霉菌懸液相對(duì)電導(dǎo)率隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈上升趨勢(shì)；處理9 h 時(shí)，費(fèi)菜黃酮處理組的相對(duì)電導(dǎo)率為19.58%，顯著高于對(duì)照組(4.61%)(P＜0.05)；當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至12 h 時(shí)，處理組的相對(duì)電導(dǎo)率升高至45.37%，顯著高于對(duì)照組(14.43%)。 表明菌體細(xì)胞膜的通透性增加，離子穩(wěn)態(tài)遭到一定的破壞。

表2 不同費(fèi)菜黃酮濃度對(duì)意大利青霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of different flavonoids concentrations against mycelial growth of P. italicum

圖1 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉分生孢子存活率的影響Fig.1 Effects of flavonoids from Sedum aizoon L.on conidia viability of the P. italicum in vitro

圖2 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉菌細(xì)胞膜通透性的影響Fig.2 Effect of flavonoids from Sedum aizoon L.on permeability of the P. italicum cell membrane

2.5 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉細(xì)胞成分釋放的影響

由圖3 可知，隨著費(fèi)萊黃酮處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組菌懸液總糖含量總體呈下降趨勢(shì)，1.75 mg·mL-1(1 MIC)費(fèi)菜黃酮處理組菌懸液總糖含量總體呈上升趨勢(shì)，處理3 h 時(shí)，處理組菌懸液總糖含量為54.43 mg·mL-1，顯著高于對(duì)照組(48.01 mg·mL-1)，處理時(shí)間延長(zhǎng)至12 h 時(shí)，處理組菌懸液總糖含量達(dá)到58.63 mg·mL-1，仍顯著高于對(duì)照組。 表明經(jīng)費(fèi)菜黃酮處理后菌體胞內(nèi)糖類(lèi)物質(zhì)泄露出胞外。

圖3 費(fèi)菜總黃酮對(duì)意大利青霉菌細(xì)胞胞外總糖含量的影響Fig.3 Effects of flavonoids from Sedum aizoon L. on total sugars of P. italicum

2.6 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉菌MDA 和H2O2 含量的影響

由圖4-A 可知，隨著費(fèi)菜黃酮處理時(shí)間的延長(zhǎng)，意大利青霉菌MDA 含量總體呈上升趨勢(shì)，以3 ～9 h內(nèi)變化最為明顯，在處理3 h 時(shí)菌絲MDA 含量達(dá)到4.06 mmol·g-1，顯著高于對(duì)照組(2.24 mmol·g-1)(P＜0.05)，處理9 h 時(shí)MDA 含量增至5.66 mmol·g-1，當(dāng)處理時(shí)間為12 h 時(shí)，意大利青霉菌絲MDA 含量有所降低，但仍顯著高于對(duì)照組(2.04 mmol·g-1)(P＜0.05)。 由圖4-B 可知，經(jīng)費(fèi)菜黃酮處理后意大利青霉菌絲H2O2含量顯著升高(P＜0.05)，處理3 h 時(shí)H2O2含量達(dá)到25.73 mmol·g-1，處理時(shí)間延長(zhǎng)至6 h時(shí)，意大利青霉菌絲H2O2含量上升至33.77 mmol·g-1，隨后H2O2含量基本穩(wěn)定。 表明費(fèi)萊黃酮處理后菌體受到氧化脅迫，暗示細(xì)胞膜受到了損傷。

圖4 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉菌MDA(A)和H2O2(B)含量的影響Fig.4 Effect of flavonoids from Sedum aizoon L. on MDA (A) and H2O2(B) contents of P. italicum cells

2.7 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉菌絲形態(tài)的影響

處理前的意大利青霉菌絲呈現(xiàn)出正常和完整的管狀結(jié)構(gòu)，并且菌絲表面平滑(圖5-A)。 而經(jīng)MIC(1.75 mg·mL-1)和MFC(7.00 mg·mL-1)黃酮處理后的菌絲發(fā)生了明顯變化，MIC 處理的菌絲局部失水凹陷，表面粗糙，出現(xiàn)褶皺(圖5-B)；MFC 黃酮處理菌絲的損傷比MIC 更為嚴(yán)重，菌絲結(jié)構(gòu)完全破壞，嚴(yán)重塌陷，同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的流失(圖5-C)。

2.8 費(fèi)菜黃酮對(duì)損傷接種意大利青霉的柑橘發(fā)病率及病斑直徑的影響

如圖6-A 所示，費(fèi)菜黃酮能抑制柑橘采后青霉病病菌的生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，即隨著費(fèi)菜黃酮濃度的升高，柑橘果實(shí)病斑直徑變小。 由圖6-B 可知，接種意大利青霉后第2 天，1.2 mg·mL-1費(fèi)菜黃酮處理組柑橘采后青霉發(fā)病率為25.92%，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；接種3 d，0.6、1.2 mg·mL-1費(fèi)菜黃酮處理組的果實(shí)發(fā)病率分別為85.19%和81.48%，均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；接種4 d，處理組和對(duì)照組發(fā)病率均達(dá)到100%，無(wú)顯著差異，說(shuō)明費(fèi)菜黃酮可能作用于發(fā)病前期。 由圖6-C 可知，接種意大利青霉后的第2天，1.2 mg·mL-1費(fèi)菜黃酮處理組果實(shí)病斑直徑在0.64 cm 以?xún)?nèi)，0.3、0.6 mg·mL-1費(fèi)菜黃酮處理組與對(duì)照組之間差異不顯著(P＞0.05)；接種后第3 天，病斑直徑迅速增大，各費(fèi)菜黃酮處理組果實(shí)病斑直徑與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P＞0.05)；接菌后第4 天，對(duì)照組果實(shí)病斑直徑達(dá)到2.94 cm，顯著高于0.6 mg·mL-1處理組(2.57 cm)及1.2 mg·mL-1處理組(2.62 cm)(P＜0.05)；接種后第5 天，病斑直徑隨著費(fèi)菜黃酮濃度的升高總體呈減小趨勢(shì)，各處理組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，但均顯著小于對(duì)照組(P＜0.05)。

圖5 費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉菌絲處理后掃描電子顯微鏡觀察Fig.5 Scanning electron microscope observation of P. italicum mycelia after flavonoids treatment

3 討論

細(xì)胞膜是細(xì)胞選擇性滲透屏障，一旦受到損傷，胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)會(huì)失衡，造成不可逆的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致菌體細(xì)胞的死亡[21-22]。 通過(guò)測(cè)定細(xì)胞膜通透性發(fā)現(xiàn)，費(fèi)菜黃酮同樣作用于菌體細(xì)胞膜，打破菌體的保護(hù)屏障，進(jìn)而引起胞內(nèi)物質(zhì)泄露，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率上升，這與馮亞凈等[23]、Paul 等[24]和李珊珊等[25]的結(jié)果相似。 糖類(lèi)是細(xì)胞內(nèi)重要的能量?jī)?chǔ)備物質(zhì)，本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組菌懸液中糖類(lèi)物質(zhì)被意大利青霉利用而減少，處理組菌懸液中總糖含量增加，表明費(fèi)菜黃酮可能作用于意大利青霉細(xì)胞膜，導(dǎo)致胞內(nèi)糖類(lèi)成分釋放，進(jìn)而說(shuō)明細(xì)胞膜損傷后胞內(nèi)功能物質(zhì)大量流失。 此外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)費(fèi)菜黃酮處理后意大利青霉菌MDA 和H2O2含量升高，在一定程度上反映了活性氧的爆發(fā)，側(cè)面說(shuō)明意大利青霉發(fā)生了氧化損傷[26]。 掃描電鏡結(jié)果顯示，處理組菌絲結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，菌絲表面出現(xiàn)褶皺、塌陷，菌體細(xì)胞質(zhì)流失，表明細(xì)胞膜損傷進(jìn)而使得意大利青霉胞內(nèi)成分釋放，說(shuō)明費(fèi)菜黃酮對(duì)意大利青霉形態(tài)功能有影響。

黃酮類(lèi)物質(zhì)具有廣譜的抑菌特性，對(duì)細(xì)菌、真菌等均具較高的抑制活性，作用于菌體使其能量代謝受到影響、破壞細(xì)胞膜的完整性、抑制核酸以及蛋白的合成表達(dá)均已被證實(shí)[27-28]。 前期研究發(fā)現(xiàn)費(fèi)菜黃酮對(duì)冷卻豬肉腐敗菌具有較好的抑制效果[29]，通過(guò)破壞細(xì)胞膜完整性，造成菌體內(nèi)環(huán)境紊亂，抑制高分子蛋白質(zhì)的表達(dá)和積累，達(dá)到抑菌和殺菌的作用。 本試驗(yàn)所用費(fèi)菜黃酮經(jīng)純化凍干其純度為45.67%，主要含有槲皮素、槲皮苷、山奈酚等[30]，費(fèi)菜黃酮對(duì)柑橘腐敗菌意大利青霉表現(xiàn)出較好的抑菌活性，MIC 為1.75 mg·mL-1，初步探索黃酮成分可能通過(guò)破壞菌體細(xì)胞膜，進(jìn)而導(dǎo)致功能性成分的釋放，達(dá)到殺菌效果，但具體是單一黃酮作用還是多種黃酮協(xié)同作用仍需進(jìn)一步研究。

柑橘果實(shí)在采后貯藏階段易受意大利青霉的侵染，采后果實(shí)青霉病的控制成為柑橘病害的研究熱點(diǎn)。目前，諸多研究通過(guò)抑制菌絲生長(zhǎng)控制了柑橘采后青霉病，Wang 等[14]發(fā)現(xiàn)肽PAF56 具較高的抑菌活性，能較好地控制柑橘采后青霉病的發(fā)生。 Tao 等[31]利用椪柑精油對(duì)意大利青霉進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)椪柑精油中活性成分可抑制菌絲的生長(zhǎng)。 本研究發(fā)現(xiàn)，費(fèi)菜黃酮可抑制意大利青霉菌絲的生長(zhǎng)，且具劑量依賴(lài)效應(yīng)，用費(fèi)菜黃酮處理后可延緩柑橘果實(shí)的發(fā)病進(jìn)程。 不同抑菌方法對(duì)柑橘青霉病在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出抑制效果，可能在體外抑菌測(cè)試中直接作用于病原菌導(dǎo)致其死亡，運(yùn)用于柑橘果實(shí)，可抑制病原菌生長(zhǎng)，從而降低發(fā)病率，減輕病菌對(duì)果實(shí)的侵害。 費(fèi)菜黃酮單一處理仍具有局限性，下一步研究可嘗試將費(fèi)菜黃酮與其他抑菌活性物質(zhì)復(fù)合應(yīng)用于柑橘保鮮。

4 結(jié)論

費(fèi)菜黃酮可以明顯抑制意大利青霉的生長(zhǎng)，通過(guò)破壞意大利青霉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)功能性物質(zhì)滲透到胞外，菌體發(fā)生氧化損傷，達(dá)到抑菌殺菌的效果。 采用費(fèi)菜黃酮處理柑橘果實(shí)，可降低果實(shí)的發(fā)病率，減小病斑直徑。 但費(fèi)菜黃酮抑菌的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探究。