金 俊 鄭方媛 周秀雯 潘家榮

(中國計量大學生命科學學院/浙江省海洋食品品質及危害物控制技術重點實驗室/海洋食品加工質量控制技術與儀器國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 杭州 310018)

對于農產品而言，產地對其品質有著重要的影響。隨著國內與國際貿易系統(tǒng)的不斷發(fā)展，消費者可消費的農產品越來越多區(qū)域化，不同產地同一產品的價格差異滋生了很多“冒名頂替”現(xiàn)象。 農產品產地溯源系統(tǒng)的建立不僅有利于加強市場的監(jiān)管，保護地方名牌優(yōu)質產品，還可在出現(xiàn)安全問題時快速鎖定污染源，控制安全隱患[7]。 目前，可作為農產品產地溯源的指標較多[8-10]，包括同位素組成、礦物質含量和組成、波譜指紋等。 由于農產品深受各種地理因素如水分、氣候、地質等的影響，不同產區(qū)的農產品具有特異的地理標志特征，而與產地環(huán)境息息相關的穩(wěn)定同位素越來越多地被應用于農產品的產地溯源。 如Federica等[11]通過測定脂肪和脫脂魚片中穩(wěn)定同位素δ13C、δ2H、δ18O、δ15N 和δ34S 來追蹤意大利北部弗留利威尼斯朱利亞和特倫蒂諾兩大地區(qū)的虹鱒魚，地理起源判別準確率高達91%。 邵圣枝等[12]采用穩(wěn)定同位素質譜和電感耦合等離子體質譜測定黑龍江、江蘇和遼寧3 個省份的稻米中同位素比率和礦物元素含量，并結合主成分分析-線性判別分析(principal component analysis-linear discriminant analysis，PCA-LDA)法進行產地判別分析，準確率為91%。 吳浩等[13]采用氣相色譜-燃燒-同位素質譜的方法測定了來自法國、澳大利亞、美國和中國4 個國家的葡萄酒中5 種易揮發(fā)組分中的δ13C 值，發(fā)現(xiàn)依靠揮發(fā)組分中單一的δ13C 指標就能有效地區(qū)分4 個產區(qū)的葡萄酒。 黃島平等[14]利用穩(wěn)定同位素比率質譜儀測定了來自廣西、湖南、福建、四川4個地區(qū)的柑橘果汁中δ13C 和δ2H 值，發(fā)現(xiàn)各地區(qū)果汁間的δ13C 和δ2H 值存在極顯著差異，可以根據果汁中的δ13C 和δ2H 值來推斷柑橘產地。 目前，穩(wěn)定同位素已較為普遍地被應用于農產品的產地溯源，尤其是δ13C、δ2H 和δ18O 的產地溯源技術研究歷史較長，然而大多數(shù)研究采用的是食品整體的同位素組成指標[15-16]。通過提取食品中的某單一組分進行同位素溯源可以減少基體組分的影響[17-18]，提高食品產地溯源的準確率，但目前相關報道還較少。 本研究擬測定不同產地車厘子的蛋白質和脂肪中δ13C、δ2H 和δ18O 的差異以驗證利用穩(wěn)定同位素分析追溯車厘產地的可行性，為日后建立完整的車厘子產地溯源系統(tǒng)提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

車厘子樣品采自澳洲、美國、智利和我國山東4 個地區(qū)。 本著準確性、隨機性原則，通過出入境渠道分區(qū)域隨機采集每個產地新鮮車厘子樣品2 kg，分裝標記，樣品分2 批采集。

三氯乙酸、聚乙烯吡咯烷酮，生工生物工程(上海)股份有限公司；丙酮，杭州雙林化工試劑有限公司；β-巰基乙醇，上海吉至生化科技有限公司；石油醚，杭州高晶精細化工有限公司。

1.2 主要儀器與設備

800Y 粉碎機，博歐制品五金有限公司；SH-25 真空冷凍干燥機，湖北思昊科學儀器有限公司；Microfuge 20R 高速冷凍離心機，江蘇省科學器材有限公司；HH-5015 恒溫水浴鍋，上海赫田科學儀器有限公司；vario PYRO cube 元素分析儀，德國Elementar 公司；isoprime 100 同位素質譜儀，英國Isoprime 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 每個產地隨機選取40 個車厘子樣品，其中20 個用于蛋白質提取，其余用于脂肪提取。人工分離樣品的果肉和果核兩部分，并對分離的果肉進行粉碎，粉碎樣品經-80℃預冷3 h 后于凍干機內在5 Pa 真空度下凍干24 h 至干粉狀態(tài)，所得樣品粉末標記備用。

1.3.2 蛋白質提取 參考植物蛋白質提取方法[19-22]，選用三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)和丙酮提取車厘子樣品中的蛋白質。 稱取凍干樣品5 g，加5 倍-20℃預冷的丙酮(含0.07% β-巰基乙醇)、TCA和10% 樣品重的聚乙烯吡咯烷酮( polyvinyl pyrrolidone，PVP)，混合搖勻，-20℃靜置沉降1 h，10 000 r·min-1離心20 min，去上清，沉淀加入10 mL-20℃預冷的丙酮(含0.07%β-巰基乙醇)，混勻，-20℃靜置沉降1 h，10 000 r·min-1離心20 min，取上清，重復洗滌沉淀2～3 次，沉淀經-80℃預冷3 h 后于凍干機內在5 Pa 真空度下凍干得蛋白質。 該方法提取的蛋白質為多種蛋白質混合的粗蛋白，參照《GB 5009.5-2016 食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[23]測定提取物中的蛋白質，每個樣本取20 mg 蛋白質備用。

1.3.3 脂肪提取 參考植物脂肪提取方法[24-26]，選用石油醚浸提的方法提取果肉中的脂肪。 稱取10 g凍干樣品、加入100 mL 石油醚，混勻，室溫下于通風櫥中靜置12 h，10 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，再向沉淀中加入石油醚浸提重復2 ～3 次，收集每次離心后的上清液于試管中，50℃水浴至重量不再變化即為脂肪。 該方法提取的脂肪為多種脂肪混合的粗脂肪，參照《GB 5009.6-2016 食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[27]測定提取物中的脂肪，每個樣本取20 mg 粗脂肪備用。

1.3.4 穩(wěn)定同位素δ13C、δ2H 和δ18O 的測定

1)8號煤層結構簡單，埋深較淺，含氣量高且具有“中部高，水公河向斜軸部高，加戛背斜軸部低”的分布特點。中部構造簡單，屬“匯水洼地”，且發(fā)育泥巖偽頂，多因素綜合作用使得煤層含氣量高；水公河向斜軸部構造簡單，水位普遍較低，水動力條件弱，煤層埋深大，有利于煤層氣的聚集賦存，煤層含氣量較高；加戛背斜軸部構造復雜，斷裂發(fā)育，且水位較高，有向中部運移的趨勢，不利于煤層氣的賦存，煤層含氣量較低。

1.3.4.1 穩(wěn)定同位素δ13C 的測定 采用元素分析-同位素比率質譜(elemental analysis-isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS)測定車厘子中δ13C 值。 稱取1～2 mg 待測樣品于錫箔杯(4 mm×4 mm×11 mm)中，通過自動進樣器送入元素分析儀，樣品中的C 元素燃燒轉化為純凈的CO2氣體，再經稀釋儀稀釋后進入同位素質譜儀進行檢測。 檢測參數(shù):元素分析儀的He吹掃流量為230 mL·min-1，載氣He 的流量為100 mL·min-1，燃燒爐和還原爐溫度分別為900℃和650℃；同位素質譜儀的檢測時間為550 s，CO2做參考氣，δ13C 的相對標準為V-PDB[28]。

1.3.4.2 穩(wěn)定同位素δ2H 和δ18O 的測定 采用元素分析儀/高溫裂解- 同位素比率質譜(elemental analyzer/high temperature pyrolysis-isotope ratio mass spectrometry，EA/HT-IRMS)測定車厘子中δ2H 和δ18O值。 稱取0.2～0.4 mg 待測樣品于銀杯(4 mm×4 mm×11 mm)中，通過自動進樣器將樣品送入元素分析儀，樣品經裂解爐高溫裂解后，其中的H 和O 元素被玻璃碳轉化為H2和CO，隨后產生的H2和CO 進入同位素質譜儀進行檢測。 檢測參數(shù):載氣He 的流量為125 mL·min-1，裂解爐溫度為1 450 ℃；同位素質譜儀的檢測時間為950 s，O2和H2做參考氣，δ18O 和δ2H 的相對標準為V-SMOW[29]。

穩(wěn)定同位素比率的計算公式為:

式中，R 為重同位素與輕同位素豐度比，即13C/12C、2H/1H、18O/16O。

1.4 數(shù)據分析與模型建立

利用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據進行差異性分析、判別分析和制圖分析。 采用Fisher 線性判別分析和逐步判別分析方法選取最佳的指標組合建立判別模型，并驗證模型的準確性和穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 不同產地車厘子蛋白質、脂肪中δ13C、δ2H 和δ18 O 的差異

由圖1 可知，不同產地車厘子果肉蛋白質和脂肪中δ13C、δ2H 和δ18O 值變化范圍不同，其中δ13C、δ18O的變化范圍較小，δ2H 的變化較大。 蛋白質中δ13C 的平均值范圍為 -31.62‰～-28.48‰，差異范圍為0.36‰～3.14‰；δ2H 的平均值范圍為-86.21‰～-68.44‰，差異范圍為4.37‰～17.77‰；δ18O 的平均值范圍為24.05‰～25.94‰，差異范圍為0.41‰～1.89‰。 脂肪中δ13C 的平均值范圍為-32.84‰～-31.14‰，差異范圍為0.52‰～1.70‰；δ2H 的平均值范圍為-123.65‰～-112.23‰，差異范圍為0.83‰～11.42‰；δ18O 的平均值范圍為22.06‰～24.21‰，差異范圍為0.59‰～2.15‰。 表明，基于果肉蛋白質和脂肪中δ13C、 δ2H 和δ18O 判別車厘子產地具有一定可行性。

圖1 不同產地車厘子蛋白質和脂肪中δ13C、δ2H 和δ18O 的值Fig.1 The values of δ13C，δ2H and δ18O in the protein and fat of the cherries from different origins

由表1 可知，不同產地車厘子樣品的蛋白質中，澳洲樣品的δ13C 值為-28.48‰，顯著高于其他3 個產地，美國樣品的δ13C 值最低，為-31.62‰；4 個產地車厘子樣品的δ2H 值互相間均存在顯著差異；4 個產地車厘子樣品的δ18O 平均值范圍為24.05‰～25.94‰，其中澳洲樣品的δ18O 值顯著低于其他3 個產地，山東樣品的δ18O 值最高，與智利和澳州樣品存在顯著差異。

不同產地車厘子樣品的脂肪中，美國樣品的δ13C值最高為-31.14‰；各產地樣品果肉脂肪中的δ2H 值差異范圍較大，為0.83‰～11.42‰，僅智利與山東產地樣品間無顯著差異；美國樣品δ18O 值僅為22.06‰，顯著低于澳洲與山東樣品。

2.2 基于不同組分中單一同位素指標的車厘子產地的判別分析

由表2 可知，不同產地車厘子蛋白質中3 種同位素的初始判別準確率為56.3%～81.3%，交叉驗證判別準確率為56.3%～75.0%；脂肪中3 種同位素的初始判別率為50.0%～75.0%，交叉驗證判別準確率為43.8%～56.3%。 6 個指標的初始判別準確率從高到低依次為:δ2H(蛋白質)＞δ2H(脂肪)＞δ18O(蛋白質)＞δ13C(蛋白質)＞δ13C(脂肪)/δ18O(脂肪)，交叉驗證判別準確率從高到低依次為:δ2H(蛋白質)＞δ18O(蛋白質)＞δ13C(蛋白質)/δ2H(脂肪)＞δ18O(脂肪)＞δ13C(脂肪)。 表明，不同產地車厘子的蛋白質和脂肪2 種組分中均是δ2H 的判別準確率最高，但初始判別準確率最高僅為81.3%，交叉驗證判別準確率僅為75.0%，單一同位素指標對車厘子產地的判別效果并不理想。

2.3 基于單一同位素指標的車厘子產地的判別分析

結合蛋白質、脂肪中相同的同位素進行產地判別分析，由表3 可知，各同位素的產地判別準確率為:δ2H＞δ18O ＞δ13C，其中δ2H 的判別準確率要遠高于δ18O 和δ13C，初始判別準確率和交叉驗證判別準確率分別達到了93.8%、87.5%。 表明，結合蛋白質和脂肪中的同位素指標可初步實現(xiàn)車厘子的產地判別，判別效果優(yōu)于單一組分中同位素指標的判別。

2.4 基于不同組分中δ13C、δ2H 和δ18O 組合指標的車厘子產地的判別分析

表4 分析比較了蛋白質、脂肪對車厘子樣品產地的判別效果，依靠脂肪中δ13C、δ2H 和δ18O 3 個指標組合的產地初始判別準確率達到了100.0%，但交叉驗證判別準確率僅為68.8%；而依靠蛋白質中δ13C、δ2H和δ18O 3 個指標組合的產地交叉驗證判別準確率達到了87.5%，但初始判別率僅為87.5%，低于脂肪的100.0%。 表明，2 種成分的產地判別效果明顯不同。

表3 不同組分的單一同位素指標組合對車厘子產地判別的準確率Table 3 Accuracy of the discrimination of cherries by the combination of single isotope index in different components /%

2.5 基于多個指標組合的車厘子產地的判別分析及溯源模型的建立

對車厘子蛋白質、脂肪中的δ13C、δ2H 和δ18O 值6項指標進行逐步判別分析，篩選重要的建模變量。 在顯著性水平下，6 項指標中有3 項被引入到判別模型中，引入的先后順序依次為蛋白質中的δ2H＞脂肪中的δ2H＞蛋白質中的δ18O，說明這3 項指標對判別函數(shù)均有顯著性作用。 由表5 可知，隨著指標的加入，樣品產地初始判別準確率由81.3%提高至100.0%，交叉驗證判別準確率由75.0%提高至93.8%，當選用的指標達到3 個(蛋白質中的δ2H、脂肪中的δ2H、蛋白質中的δ18O)，產地判別的準確率不再隨著指標的加入而升高。 可見，利用車厘子果肉蛋白質中的δ2H、δ18O 和脂肪中的δ2H 等3 個指標即可有效實現(xiàn)車厘子的產地溯源。 利用上述選定的3 個指標做Fisher 線性判別分析，判別函數(shù)分別為:Y(澳洲)= -31.99X1-39.71X2+77.13X3-4 641.26；Y(美國)= -31.07X1-36.27X2+86.26X3-4 394.30；Y(智利)= -29.85X1-40.96X2+73.93X3-4 543.50；Y(山東)= -29.19X1-39.71X2+78.35X3-4 454.86； 各模型中的X1、X2、X3分別為蛋白質中的δ2H、脂肪中的δ2H、蛋白質中的δ18O。

表4 不同組分對車厘子產地判別的準確率Table 4 Accuracy of different components for discrimination of cherries origins /%

在實際應用中，依據所建立的判別模型，可對上述4 個產地的車厘子盲樣進行判別分類。 將試驗測得的各樣品蛋白質中的δ2H、δ18O 和脂肪中的δ2H 代入上述各模型，而盲樣則歸屬于Y值最大的地區(qū)。

表5 多個同位素指標組合對車厘子產地判別的準確率Table 5 Accuracy of multiple isotope index combinations for discrimination of cherries origins /%

3 討論

當前，我國線上線下銷售的進口車厘子主要來自于澳洲、美國、智利3 個國家，國產車厘子大部分來自于山東、四川、福建等地區(qū)。 不同產地車厘子中穩(wěn)定同位素比率和當?shù)氐牡乩怼夂蛎芮邢嚓P[30-32]，在植物源性食品的產地溯源研究中，穩(wěn)定同位素受外界人為因素的影響較小，地理特性明顯。 因此，本試驗通過測定車厘子果肉中蛋白質和脂肪2 種單獨組分中碳、氫、氧3 種同位素豐度的地區(qū)差異，利用顯著性分析、判別分析等統(tǒng)計學分析手段來區(qū)分試驗地區(qū)的車厘子。

蛋白質、脂肪中的同位素比率測定結果顯示，不同產地車厘子中δ13C、δ2H 和δ18O 均存在顯著性差異。植物中的碳元素主要來源于光合作用途徑，受大氣、光照、溫度等外部環(huán)境因子的影響，各地區(qū)樣本蛋白質中δ13C 的平均值存在差異且與產地當?shù)貧鉁鼗境收嚓P的變化趨勢，可能是溫度升高影響了植物碳同位素分餾的結果，這與劉賢趙等[33]和胡啟武等[34]對C3草本植物δ13C 與溫度關系的研究結果基本相符；但樣品蛋白質中δ13C 與脂肪中δ13C 的產地變化趨勢并不相同，這可能與這2 種組分在植物體中合成代謝途徑不同有關。 植物中氫、氧同位素的豐度主要受當?shù)厮h(huán)系統(tǒng)、氣溫、海拔等環(huán)境因子影響，4 個產地車厘子中δ18O、δ2H 顯著差異，可能與這些地區(qū)的水循環(huán)系統(tǒng)存在差異有關。 此外，同位素測定結果顯示，同一產區(qū)的車厘子蛋白質和脂肪之間的δ13C、δ2H 和δ18O 普遍存在顯著性差異，這可能與植物體中蛋白質、脂肪的代謝途徑不同有關。 基于各產地車厘子中δ13C、δ2H和δ18O 存在差異，采用判別分析的統(tǒng)計學方法進行產地判別，基于蛋白質或脂肪中的δ13C、δ2H 和δ18O 對車厘子產地均具有一定的判別效果，但判別準確率并不高，其中基于脂肪中同位素的產地判別準確率僅為68.8%，這可能與樣品基數(shù)較小有關，后續(xù)應繼續(xù)擴大采樣量和增加采樣地區(qū)。

近年來，氣相色譜質譜聯(lián)用[35]、近紅外光譜[36]、拉曼光譜[37]和DNA 條形碼[38]等新型分析技術逐漸應用于農產品產地溯源研究領域，這些技術所測定的指標易受農產品成熟度、人為加工等因素影響，存在一定的局限性，而植物源性農產品中的穩(wěn)定同位素受這些因素的影響較小，因此，利用穩(wěn)定同位素分析判別車厘子原產地具有一定的可行性，可為后續(xù)建立植物源性食品或車厘子的產地溯源平臺提供一定的理論基礎，具有重要的現(xiàn)實意義。

4 結論

本研究采用穩(wěn)定同位素比率質譜儀測定澳洲、美國、智利、山東4 個產地車厘子中蛋白質和脂肪中的碳、氫、氧同位素比率。 結果發(fā)現(xiàn)，單一蛋白質組分對產地的初始判別準確率為87.5%，交叉驗證判別準確率為87.5%，單一脂肪組分的初始判別準確率為100.0%，交叉驗證判別準確率為68.8%。 結合單因素方差分析、逐步判別分析和Fisher 線性判別分析等多元統(tǒng)計分析手段，選用蛋白質中的δ2H、δ18O 和脂肪中的δ2H 這3 個指標耦合，可有效區(qū)分4 個產地的樣品，且判別準確模型的初始判別準確率達到100.0%，交叉驗證判別率達到93.8%。