郝志云 王繼卿 胡 江 劉 秀 李少斌 羅玉柱

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省牛羊基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070)

乳腺是哺乳動(dòng)物唯一重復(fù)經(jīng)歷生長(zhǎng)、功能分化和退化的器官，在動(dòng)物的繁育過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。 乳蛋白是乳汁的重要組成部分，是衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)，主要由酪蛋白、乳清蛋白和乳脂球膜蛋白(milk fat globule membrane proteins，MFGMPs)等組成。 MFGMPs 僅占乳蛋白總含量的1%～2%，但具有抑制癌細(xì)胞、抗病毒感染、增強(qiáng)機(jī)體免疫等重要功能[2-4]。 糖基化依賴細(xì)胞粘附分子(glycosylationdependent cell adhesion molecule 1，GlyCAM-1)屬于粘液素(mucin)糖蛋白家族的一員，是MFGMPs 的重要組成部分，具有參與細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及介導(dǎo)白細(xì)胞粘附和淋巴細(xì)胞歸巢等生物學(xué)功能，同時(shí)在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。 此外，GlyCAM-1 作為胚胎和子宮內(nèi)膜特異受體的配體，參與整合素介導(dǎo)的粘膜級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6]。 在乳腺中，GlyCAM-1 作為一種受激素調(diào)節(jié)的MFGMPs 重要組成部分參與乳腺發(fā)育及乳汁分泌過(guò)程[7-8]。 Suárez Vega 等[9]通過(guò)對(duì)2 個(gè)乳用綿羊品種(Ovis aries)Assaf(年產(chǎn)量400 kg)和Churra(年產(chǎn)量117 kg)在泌乳第10、第50、第120、第150 天的乳體細(xì)胞(milk somatic cells，MSC)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，GlyCAM-1 在整個(gè)泌乳時(shí)期均高表達(dá)(xFRPM=26 274)，但在各時(shí)期表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)。 Paten 等[10]在研究羅姆尼母羊時(shí)發(fā)現(xiàn)，GlyCAM-1 在產(chǎn)后15 d 乳腺組織中的表達(dá)量高于妊娠后135 d，表明在乳汁分泌過(guò)程中GlyCAM-1 基因的表達(dá)量會(huì)上升。 由此表明，GlyCAM-1 在家畜泌乳和乳腺發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，但是關(guān)于該基因的序列特征、核苷酸序列變異和表達(dá)特征尚不清楚。

為了系統(tǒng)研究綿羊GlyCAM-1 基因的核苷酸序列特征及其變異、組織表達(dá)特征，本研究以高泌乳量的小尾寒羊(泌乳高峰期和空懷期)和低泌乳量的甘肅高山細(xì)毛羊(泌乳高峰期)為對(duì)象，應(yīng)用基因克隆、生物信息學(xué)、測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real timequantitative PCR，RT-qPCR)等技術(shù)，對(duì)該基因進(jìn)行了CDS 區(qū)域克隆、氨基酸序列特征分析，研究了該基因CDS 區(qū)的核苷酸序列變異，檢測(cè)了乳腺、心臟、肝臟、脾臟等8 個(gè)組織中該基因的mRNA 表達(dá)特征，以期為研究GlyCAM-1 基因的泌乳生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品采自甘肅省天祝縣松山鎮(zhèn)金子河綿羊繁育場(chǎng)，選擇處于泌乳高峰期(產(chǎn)后第3 周)的高泌乳量小尾寒羊和低泌乳量甘肅高山細(xì)毛羊各3 只，另外選擇處于空懷期的小尾寒羊3 只，合計(jì)9 只試驗(yàn)羊。 要求所有試驗(yàn)羊均為3 歲、第4 胎、在同一飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)管理。 屠宰后立即采取乳腺、心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、卵巢和背最長(zhǎng)肌各0.5 g 左右。 乳腺組織樣用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水沖洗除去殘留的乳汁之后，裝入2 mL 凍存管后立即置于液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

按照Trizol Reagent(Invitrogen，CA，USA)說(shuō)明書(shū)要求，提取組織中的總RNA。 提取后的RNA 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，用Nanoprop 2000 型超微量分光光度計(jì)(塞默飛，美國(guó))檢測(cè)OD260/OD280及其濃度，質(zhì)量合格的RNA 保存于-80℃冰箱中備用。 根據(jù)天根反轉(zhuǎn)錄FastKing RT kit(with gDNase)說(shuō)明書(shū)要求，對(duì)RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA 按照其濃度稀釋成100 ng·μL-1溶液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 GLYCAL-1 基因引物設(shè)計(jì)及克隆

依據(jù)GenBank 中預(yù)測(cè)的綿羊GlyCAM-1 基因的mRNA 序列(XM＿012149360.2)，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)P1 和P2 引物，其中P1 引物用于GlyCAM-1 基因CDS區(qū)的克隆，P2 引物用于RT-qPCR 分析，β-actin基因?yàn)閮?nèi)參引物，引物具體信息見(jiàn)表1。 以小尾寒羊乳腺組織中獲得的cDNA 為模板，采用20 μL 反應(yīng)體系，包括cDNA 0.8 μL(約100 ng·μL-1)，5 U·μL-1Taq 預(yù)混酶10 μL，0.25 μmol·L-1上、下游引物各0.8 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。 PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min；4℃保存。 PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)。 選擇目的條帶進(jìn)行切膠回收并連接至克隆載體pMD19-T，經(jīng)轉(zhuǎn)化、PCR 鑒定后挑取陽(yáng)性單克隆穿刺培養(yǎng)，送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。 以泌乳高峰期小尾寒羊(3 個(gè))和甘肅高山細(xì)毛羊(3 個(gè))乳腺組織的cDNA 為模板，擴(kuò)增P1 引物，將其擴(kuò)增片段直接測(cè)序鑒定其核苷酸序列變異特征。

表1 綿羊GlyCAM-1 基因的擴(kuò)增引物信息Table 1 Primer information for sheep GlyCAM-1 gene

1.4 GLYCAM-1 基因生物信息學(xué)分析

基于克隆獲得的綿羊GlyCAM-1 基因序列，利用DNAStar 7.1 軟件查找該基因的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)，并利用NCBI 中的BLAST 進(jìn)行驗(yàn)證；用ExPasy 站點(diǎn)上的ProtParam 軟件分析綿羊GlyCAM-1 的氨基酸特征；利用ExPaSy 站點(diǎn)上的SOPMA 分析其蛋白結(jié)構(gòu)；用NetPhos 3.1 預(yù)測(cè)氨基酸序列中潛在的磷酸化位點(diǎn)[11]；利用GO 和KEGG 分析其參與的生物學(xué)功能和代謝通路，利用String[12]在線分析GlyCAM-1 的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 GlyCAM-1 基因表達(dá)量分析

采用相對(duì)定量SYBR Green Ⅰ(TaKaRa，大連)染料法檢測(cè)GlyCAM-1 基因的組織表達(dá)量。 采用20 μL體系，包括cDNA 模板2 μL(＜100 ng)，0.25 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL、10 μmol·L-1SYBR qPCR Master Mix 10 μL、ROX Ⅱ0.4 μL 和RNase-free ddH2O 6.8 μL。 RT-qPCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃退火34 s，72℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。 溶解反應(yīng):95℃變性15 s；60℃采集熒光信號(hào)60 s。 每個(gè)反應(yīng)設(shè)3 個(gè)平行對(duì)照。 待反應(yīng)結(jié)束后依據(jù)結(jié)果報(bào)告，分析其熒光定量溶解曲線，判斷是否存在引物二聚體，以及PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，收集數(shù)據(jù)，計(jì)算表達(dá)量[13]。 反應(yīng)在Applied Biosystems QuantStudio ? 6 Flex 儀(Thermo Fisher，USA)中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GlyCAM-1 基因的克隆

以小尾寒羊的乳腺cDNA 為模板，用RT-PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 結(jié)果表明，目的片段條帶(465 bp)跟預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。 測(cè)序后獲得該基因的完整CDS 區(qū)序列，大小為465 bp，編碼154 個(gè)氨基酸。 序列已提交至GenBank，登錄號(hào)為MH917952.1。

圖1 綿羊GlyCAM-1 基因PCR 電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of GlyCAM-1 gene of sheep

通過(guò)BLAST 分析發(fā)現(xiàn)，MH917952.1 與山羊的GlyCAM-1 具有較高的序列同源性(98.7%)，與黃牛GlyCAM-1 之間的同源性為88.96%。 利用GenBank中山羊(Capra hircus)、野牦牛(Bos mutus)、黃牛(Bos taurus)、藏羚羊(Pantholops hodgsonii)、大鼠(Rattus norvegicus)、 小 鼠(Mus musculus) 和 人 類(Homo sapiens)GlyCAM-1 的氨基酸序列，結(jié)合本研究中獲得的MH917952.1 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 由圖2 可知，MH917952.1 首先與山羊的GlyCAM-1 序列聚到一支，然后與藏羚羊、野牦牛和黃牛的序列聚到一起，說(shuō)明獲得的MH917952.1 為綿羊的GlyCAM-1 序列。

2.2 GlyCAM-1 蛋白理化性質(zhì)

綿羊GlyCAM-1 蛋白的原子組成為C749H1234N200O241S4，分子質(zhì)量為17 025.47，等電點(diǎn)為5.27。 在編碼的154 個(gè)氨基酸中，根據(jù)R 側(cè)鏈的電荷數(shù)和極性，可以分為兩類:1)極性氨基酸，占總氨基酸數(shù)目的57.15%，包括20 個(gè)帶正電荷的極性氨基酸(R + K +H)(12.99%)，22 個(gè)帶負(fù)電荷的極性氨基酸(D + E)(14.29%)和46 個(gè)不帶電荷的極性氨基酸(G、S、T、C、Y、N、Q)(29.87%)；2)66 個(gè)非極性氨基酸(A、Ⅴ、Ⅰ、L、F、 W、 M、 P)，占總氨基酸數(shù)目的42.85%。GlyCAM-1 的消光系數(shù)在280 nm 時(shí)為1 490，不穩(wěn)定系數(shù)為49.83，說(shuō)明該蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白。GlyCAM-1 在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為95.06，總平均親水性為-0.442，說(shuō)明該蛋白是一個(gè)可溶性蛋白。

圖2 GlyCAM-1 氨基酸序列的同源性分析Fig.2 Homology analysis of the amino acid sequence of GlyCAM-1

綿羊GlyCAM-1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由76 個(gè)α-螺旋(helix)(49.35%)、73 個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲(coil)(47.40%)和5 個(gè)延伸鏈(extended strand)(3.25%)組成。 磷酸化位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果表明，該蛋白功能區(qū)域富含絲氨酸(16 個(gè))和蘇氨酸(10 個(gè))磷酸化位點(diǎn)。 GO 功能注釋結(jié)果表明，GlyCAM-1 基因主要注釋到蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合及細(xì)胞粘附等生物學(xué)過(guò)程中。 KEGG 分析結(jié)果表明，GlyCAM-1 基因注釋到細(xì)胞粘附分子代謝通路中。 String 分析結(jié)果表明，GlyCAM - 1 同催乳素(prolactin，PRL)蛋白、粘膜血管貼壁細(xì)胞黏附分子1(mucosal vascular addressing cell adhesion molecule 1，MadCAM-1)、CD34 和L-選擇素(L-selectin)具有直接的聯(lián)系(圖3)。

圖3 綿羊GlyCAM-1 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖Fig.3 The protein interaction network of sheep GlyCAM-1

2.3 GlyCAM-1 基因核苷酸序列變異特征分析

測(cè)序結(jié)果表明，在GlyCAM-1 基因CDS 區(qū)檢測(cè)到7 個(gè)SNPs，其中2 個(gè)為同義突變:c. 39 C＞T(p. A)和c. 258 G＞A(p. L)；5 個(gè)為錯(cuò)義突變，分別為c. 41 C＞T(p. A14V)、c. 43 A ＞G(p. T15A)、c. 279 A ＞T(p.Q93H)、c. 292 A ＞T(p. T98S)和c. 371 A ＞G(p.H124R)。

2.4 GlyCAM-1 基因的表達(dá)特征分析

利用RT-qPCR 法檢測(cè)處于泌乳高峰期的小尾寒羊和甘肅高山細(xì)毛羊中GlyCAM-1 基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌、卵巢和乳腺組織中的表達(dá)量，同時(shí)檢測(cè)該基因在空懷期小尾寒羊乳腺組織中的表達(dá)量。 由圖4 可知，GlyCAM-1 基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性。 在檢測(cè)的8 個(gè)組織中，GlyCAM-1基因在乳腺中的表達(dá)量最高，在肺臟組織中微弱表達(dá)，在其他6 個(gè)組織中均不表達(dá)。 同時(shí)GlyCAM-1 的表達(dá)也呈現(xiàn)出品種特異性，在泌乳高峰期的乳腺組織中，GlyCAM-1 基因在小尾寒羊中的表達(dá)量是甘肅高山細(xì)毛羊的1.6 倍(P＜0.05)。 此外，不同泌乳時(shí)期，GlyCAM-1 的表達(dá)量也不同。 小尾寒羊中GlyCAM-1基因在泌乳高峰期中的表達(dá)量是空懷期表達(dá)量的25倍(P＜0.01)。

圖4 GlyCAM-1 基因在小尾寒羊和甘肅高山細(xì)毛羊不同組織中的表達(dá)量Fig.4 Expression of GlyCAM-1 gene in different tissues of Small Tail Han sheep and Gansu alpine merino sheep

3 討論

3.1 MFGMPs 的生物學(xué)功能

MFGMPs 是乳中的一種重要蛋白質(zhì)，主要以乳脂肪球膜的形式存在，在乳腺分泌細(xì)胞內(nèi)形成并分泌到乳汁中。 盡管MFGMPs 只占牛奶總蛋白質(zhì)含量的1%～2%，但具有多樣性的生物學(xué)功能，在幼崽的細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程及防御機(jī)能[3，14]、動(dòng)物的免疫和發(fā)育等過(guò)程發(fā)揮了重要作用。 此外，Haramizu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MFGMPs 還可以提高小鼠的耐力和肌肉運(yùn)動(dòng)能力。 在新生兒的輔食中添加MFGMPs，可減少腹瀉的發(fā)生[2]。MFGMPs 的數(shù)量和含量存在物種差異性，如奶牛[16]、奶山羊[17]和綿羊[4]乳中的MFGMPs 的數(shù)量和含量各不相同。 粘液素是粘膜物理屏障的組成部分，可以作為物理屏障防御病原微生物對(duì)呼吸道、胃腸道和子宮內(nèi)膜等部位的感染。 作為MFGMPs 的重要組成成分，GlyCAM-1 同樣在免疫保護(hù)和細(xì)胞粘附方面具有重要的作用[18]。 研究發(fā)現(xiàn)，GlyCAM-1 的表達(dá)量與乳蛋白含量呈正相關(guān)。 Ji 等[19]利用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術(shù)鑒定了牦牛和奶牛的乳脂球膜蛋白，發(fā)現(xiàn)在高乳蛋白率(5.16%)的牦牛乳汁中，GlyCAM-1 高度富集，并且是低乳蛋白率(2.79%)奶牛的10.15 倍。 由于綿羊的乳蛋白含量(5.15%)顯著高于山羊(4.10%)和奶牛[20-21]，推測(cè)綿羊乳中GlyCAM-1 表達(dá)量可能也高于山羊和奶牛，但還需進(jìn)一步證實(shí)。

3.2 GlyCAM-1 序列特征及生物信息學(xué)分析

本研究利用RT-PCR 方法首次克隆了綿羊GlyCAM-1 基因的編碼區(qū)序列。 序列比對(duì)表明，綿羊GlyCAM-1 的氨基酸序列與山羊具有較高的同源性(98.7%)，與黃牛之間的同源性為88.96%。 通過(guò)直接測(cè)序技術(shù)在GlyCAM-1 基因中檢測(cè)到7 個(gè)SNPs，表明該基因具有豐富的多態(tài)性。 李晶等[22]研究發(fā)現(xiàn)，GlyCAM-1 的核苷酸變異與奶牛乳房炎有相關(guān)性，GlyCAM-1 第3 外顯子2081 處A＞T 的變異降低了乳房炎的感染率。 GO 功能注釋表明GlyCAM-1 基因主要參與蛋白結(jié)合、離子結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程，KEGG 結(jié)果表明GlyCAM-1 參與細(xì)胞分子粘附代謝通路。 細(xì)胞粘附分子是在細(xì)胞表面表達(dá)的糖蛋白，且在包括止血、免疫應(yīng)答、炎癥、胚胎發(fā)生等多種生物過(guò)程中起關(guān)鍵作用。 在淋巴器官中，GlyCAM-1 作為L(zhǎng)-選擇蛋白的配體參與了淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用[23]，使細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間，或細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞間發(fā)生粘附，從而參與細(xì)胞的識(shí)別、活化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞的增殖與分化。 因此，GlyCAM-1 可以通過(guò)該途徑調(diào)控乳腺細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[24]。

蛋白互作研究可以在分子水平揭示蛋白質(zhì)功能以及包括生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、分化和凋亡在內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)規(guī)律[24]。 通過(guò)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，GlyCAM-1 與PRL、L-Selectin、MadCAM-1 和CD34 蛋白具有直接的作用。 GlyCAM-1、MadCAM-1 和CD34 都是L-選擇素的配體，具有粘蛋白樣多肽結(jié)構(gòu)和硫酸化的O-連接聚糖[25]，它們通過(guò)粘附參與細(xì)胞的識(shí)別、活化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖及凋亡等過(guò)程。 蛋白質(zhì)半衰期與其穩(wěn)定性有關(guān)。 賈浩等[26]發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的半衰期長(zhǎng)，其穩(wěn)定性高。 本研究結(jié)果表明，GlyCAM-1 基因編碼的蛋白具有較長(zhǎng)的半衰期，但屬于不穩(wěn)定蛋白，這可能與該蛋白富含絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)有關(guān)，磷酸化使得該蛋白的穩(wěn)定性降低[27-28]。

3.3 GlyCAM-1 基因組織表達(dá)特征分析

本研究中，GlyCAM-1 基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性、品種特異性和時(shí)空特異性。 在8 個(gè)組織中，GlyCAM-1 基因在泌乳期的乳腺組織中高表達(dá)，在空懷期乳腺組織和肺臟組織中也有少量表達(dá)，其他組織中均不表達(dá)，這與前人研究結(jié)果相一致。 研究表明，GLYCAM-1 基因在泌乳期奶牛和小鼠的乳腺組織中高度表達(dá)，同時(shí)在肺臟組織、子宮中也表達(dá)[29-31]。GlyCAM-1 在乳腺上皮細(xì)胞合成后分泌到乳汁中[7]，其表達(dá)量受到激素和外源性刺激的調(diào)控。 例如催乳素(prolactin，PRL)能誘導(dǎo)GlyCAM-1 的表達(dá)，而孕酮?jiǎng)t抑制了該基因的表達(dá)[32]。 斷奶10 d 后，乳腺中的GlyCAM-1 表達(dá)量降至極低的水平，表明乳腺中GlyCAM-1 的調(diào)節(jié)與其他乳蛋白質(zhì)相似，都需要通過(guò)哺乳幼崽等外源性刺激才能繼續(xù)表達(dá)[33]。GlyCAM-1基因在子宮和胚胎著床階段的表達(dá)也進(jìn)行了較多的研究。 綿羊子宮中GlyCAM-1 mRNA 和蛋白質(zhì)的水平與處于發(fā)情周期的子宮內(nèi)膜上皮中孕酮受體表達(dá)的變化趨勢(shì)非常相似，這表明黃體酮可能是子宮中GlyCAM-1 的潛在調(diào)節(jié)因子[31]。 本試驗(yàn)中，GlyCAM-1基因在高泌乳量小尾寒羊乳腺組織中的表達(dá)量顯著高于低泌乳量甘肅高山細(xì)毛羊乳腺組織，說(shuō)明該基因能促進(jìn)綿羊的泌乳，這與Romney 綿羊乳腺組織中的研究結(jié)果相似[10]。 在產(chǎn)奶量有顯著差異的Assaf(400 kg)和Churra(117 kg)綿羊之間，GlyCAM-1 表達(dá)量并無(wú)顯著差異(P＞0.05)[9]，這可能與研究中不同的RNA 來(lái)源有關(guān)，本研究分析的是乳腺組織，而Suárez Vega 等[9]采用乳汁中的MSC 檢測(cè)其各時(shí)期的基因表達(dá)譜。 Cánovas 等[34]和Wickramasinghe 等[35]已證實(shí)奶牛乳腺和MSC 之間基因的表達(dá)模式有較大的差異。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在空懷期小尾寒羊乳腺組織中，GlyCAM-1 基因的表達(dá)量很低，但在乳汁合成過(guò)程中，該基因的表達(dá)量又上升。 在乳腺的發(fā)育及乳汁合成中，該基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)與激素分泌有關(guān)，GlyCAM-1 基因受到PRL 的誘導(dǎo)才能表達(dá)。 PRL 在發(fā)情期開(kāi)始分泌，導(dǎo)致該基因在泌乳高峰期有較高的表達(dá)量，而在空懷期表達(dá)量很低[36]。 同時(shí)，GlyCAM-1 在不同乳腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量差異可能還與腺泡發(fā)育有關(guān)[32]。 與空懷期相比，泌乳高峰期的乳腺中含有大量的腺泡，這也導(dǎo)致了該基因在泌乳高峰期有較高的表達(dá)量。

4 結(jié)論

本研究首次克隆獲得了小尾寒羊GlyCAM-1 基因的CDS 全長(zhǎng)序列，該基因編碼154 個(gè)氨基酸。 綿羊的GlyCAM-1 氨基酸序列與山羊和牛的GlyCAM-1 具有較高的序列同源性。 GlyCAM-1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。 蛋白互作分析結(jié)果表明，GlyCAM-1 蛋白與CD34、MadCAM-1 都作為L(zhǎng)-選擇素的配體發(fā)揮作用。 此外，GlyCAM-1 基因的CDS區(qū)發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)SNPs(包括2 個(gè)同義突變和5 個(gè)非同義突變)。GlyCAM-1 基因在綿羊上的表達(dá)具有明顯的組織特異性、品種特異性和時(shí)空特異性。 本研究結(jié)果豐富了綿羊基因組數(shù)據(jù)，為深入研究GlyCAM-1 基因的泌乳生物學(xué)功能及其機(jī)理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。