陳雪燕 劉艷艷 譚晴晴 任金瑞 姜欣欣 姜秀梅 劉中華 張全芳

(1山東農業(yè)科學院生物技術研究中心/山東省農業(yè)科學院應用生命科學實驗室，山東濟南 250100；2 山東濟南梅園鐵皮石斛種植有限公司，山東 濟南 250100；3山東沃森農業(yè)科技有限公司，山東 德州 255039)

鐵皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)系蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物[1-2]，主要分布在我國的南方區(qū)域，喜溫暖濕潤氣候，長于密林樹干或巖縫中。 鐵皮石斛為我國傳統(tǒng)貴細藥材，常以干燥莖或楓斗入藥，在中國許多著名醫(yī)書上均有用藥記載，具有生津益胃、養(yǎng)陰清熱、潤肺益腎之功效。 現(xiàn)代醫(yī)學研究證明，鐵皮石斛中含有的多糖、石斛酚、石斛堿、聯(lián)芐類和菲類等化合物均與消化系統(tǒng)、衰老、免疫力、腫瘤、血糖、白內障、心腦血管系統(tǒng)疾病的治療有關[3-4]。 2018年，國家衛(wèi)計委建議將鐵皮石斛列為藥食兩用原料名單，其藥用、食用價值的應用將更為廣泛。 在鐵皮石斛行業(yè)的發(fā)展迎來新機遇的同時，也遇到了新的挑戰(zhàn)，隨著市場需求量的增大，野生資源的稀缺，供需關系矛盾導致市場上出現(xiàn)各種各樣的“鐵皮石斛”，加工出的楓斗更是真假難辨，大量的混淆品和偽品嚴重影響了鐵皮石斛作為名貴藥材的品質和價值。 如何保障鐵皮石斛種質資源的真實性以及鐵皮石斛產業(yè)的健康發(fā)展顯得尤為重要。

藥用石斛品種鑒定工作最早始于20 世紀30年代，日本學者木村康一對搜集來自中國、日本等不同產地中藥石斛和楓斗進行了詳細記述和生藥學研究，可簡單鑒別出鐵皮石斛和其他石斛屬植物。 此后，由于鐵皮石斛的藥用價值引起不少學者關注，鑒定鐵皮石斛的研究方法也越來越多，主要有原植物鑒定、性狀顯微鑒定、色譜鑒定、光譜鑒定、液相鑒定以及分子標記鑒定等技術。 傳統(tǒng)方法存在局限性、準確性低、儀器配套成本高、操作復雜等問題，分子標記法以不同物種遺傳物質DNA 的差異來進行鑒定，不受物種個體形態(tài)、發(fā)育等的影響，具有用樣量少、簡便易行、準確性和多態(tài)性高等優(yōu)點，被廣泛應用于鐵皮石斛的鑒定研究，如RAPD 標記[5-7]、ISSR[8-9]、SSR 標記[10-12]、AFLP 標記[13-14]、SRAP 標 記[15-17]、SCAR 標 記[18]、EST[19-20]標記以及DNA 條形碼(DNA barcoding)[21]的研究均有報道。 實時熒光定量PCR 技術融合了核酸擴增、酶動力學、光譜分析技術的優(yōu)勢，在中醫(yī)領域的中醫(yī)診斷、中藥藥理、證實質、針刺作用機制研究等方面發(fā)揮了作用[22-23]。 目前該技術在基原鑒定方面還應用于動物、西紅花、川貝母等研究[24-25]，而在鐵皮石斛的基原鑒定上鮮有報道，尤其是TaqMan探針法更鮮見報道。 本研究探討了DNA 條形碼技術和TaqMan 探針法在鑒定鐵皮石斛以及石斛屬植物研究中的應用，以期為鐵皮石斛的資源保護與利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為蘭科植物15 個物種，其中石斛屬14個、蝴蝶蘭屬1 個，共101 個樣本，分別由山東沃森農業(yè)科技有限公司、濟南梅園鐵皮石斛種植有限公司和山東省農業(yè)科學院蔬菜花卉所提供(見表1)。 其中14 種石斛屬植物由山東省百味堂中藥飲片有限公司質量總監(jiān)葛付存鑒定，憑證樣本保存于樣品采集基地。

表1 本研究的樣品信息Table 1 Sample information for this study

1.2 主要儀器與設備

QuantStudioTM7 Flex 實時熒光定量PCR 儀，美國Thermo Fisher Scientific；T100PCR 儀、Tanon3500 凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；5424 D 高速離心機，德國Eppendorf 公司； UV3600 紫外分光光度計，日本島津；3730XL 測序儀，美國ABI 公司。 高效植物基因組DNA 提取試劑盒[DP350，天根生化科技(北京)有限公司]，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。 2×TaqMan Master Mix，上海DBI Bioscience 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA 提取、PCR 擴增及測序 稱取樣本鮮葉0.1 g，在液氮下研磨至粉末。 使用植物基因組DNA提取試劑盒提取總基因組DNA，提取的DNA 經紫外分光光度計測定OD260/OD280值，PCR 擴增體系(25 μL):2×Taq mastermix 12.5 μL、10 μmol·L-1正反向引物各取1 μL，DNA 模板2 μL、ddH2O 8.5 μL。 擴增程序:94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50～55℃退火30 s(不同引物及退火溫度見表2)，72℃延伸45 s，40 個循環(huán)；72℃終延伸10 min。 PCR 產物經電泳、純化，測序由山東省農業(yè)科學院生物技術研究中心完成。

表2 ITS、psbA-trnH、matK 及rbcL 基因引物序列及退火溫度Table 2 The primer sequences and annealing temperature of ITS、psbA-trnH、matK and rbcL gene

1.3.2 序列比對與分析 所測DNA 序列使用SeqMan 程序拼接、序列比對和人工校正，去除低質量峰區(qū)序列；在Genbank 數(shù)據庫中下載15 種石斛屬植物序列，序列信息見表3。 使用MEGA7.0 計算DNA 條形碼中ITS、psbA-trnH、matK及rbcL4 個基因在鐵皮石斛種內與14 種石斛植物種間變異，采用相似性搜索法(BLAST1)、K2P(Kimura2-parameter)雙參數(shù)遺傳距離分析鑒定能力，構建Neighbor-joining(NJ)進化樹評估4 個基因在石斛屬之間的親緣關系。

表3 本研究使用的石斛類GenBank 登錄號Table 3 GenBank accession numbers of Dendrobium species

1.3.3 PCR 引物及TaqMan 探針的設計 綜合分析結果，選擇最優(yōu)的DNA 條形碼ITS 作為靶基因，利用Primer 5.0 分別設計鐵皮石斛特異引物(TP)和特異性探針(TPP)，設計石斛屬通用引物(USH)及通用探針(USHP)。 引物及探針修飾見表4。

表4 引物與探針序列Table 4 Primers and probe sequences

1.3.4 多重熒光PCR 檢測方法的建立 以野生鐵皮石斛的基因組DNA 為模板，上、下游引物濃度以1.0 ～10.0 μmol·L-1為區(qū)間，以2.0 μmol·L-1濃度梯度遞增；探針濃度以1.0 ～5.0 μmol·L-1為 區(qū) 間，以1.0 μmol·L-1梯度遞增；退火溫度以56 ～64℃為區(qū)間，以2℃逐漸遞增，每次試驗采取等量DNA 模板，設置一個變量，每個反應條件重復試驗3 次。 對擴增所得數(shù)據進行分析，以閾值(Ct 值)最小、熒光信號強度最高和Ct 值標準偏差最小為依據，同時保證擴增效率和探針的特異性等，最終確定最佳退火溫度。 通過對單一熒光定量PCR 反應體系中的Taq 酶用量、引物濃度、探針濃度和退火溫度的優(yōu)化，建立鐵皮石斛的單重熒光定量PCR 方法。

在單一熒光PCR 建立的最優(yōu)體系和確保試驗特異性及穩(wěn)定性的基礎上，在同一反應體系中分別加入鐵皮石斛特異引物、特異探針，石斛屬通用引物和通用探針，并根據Ct 值和熒光增量，對各引物、探針濃度及循環(huán)參數(shù)進行調整優(yōu)化，最終確定多重實時熒光PCR檢測體系和方法。

1.3.5 多重實時熒光PCR 方法特異性和靈敏度檢測 在供試的14 種石斛屬植物各自樣本DNA 中，分別隨機選取1 份作為模板，按照上述優(yōu)化的反應體系和反應條件進行熒光定量PCR，檢測引物和探針的特異性。 將鐵皮石斛的基因組DNA 定量到5 ng·μL-1，按照5 倍逐級稀釋作為標準品。 每個反應加量為2 μL，各濃度梯度樣品均設置3 次重復，使用優(yōu)化好的多重實時熒光PCR 體系及條件進行擴增，評價鐵皮石斛特異引物和探針的靈敏度。

1.3.6 實際樣品檢測 將供試的14 種石斛屬植物各自樣本DNA 分別隨機選取1 份作為模板，使用優(yōu)化后的多重實時熒光PCR 檢測方法測試實際樣品，與測序方法對比，并驗證方法的準確性、可行性，每個樣本設置3 個重復。

2 結果與分析

2.1 樣品序列比對、遺傳變異、系統(tǒng)進化樹分析

DNA 條形碼中ITS、psbA-trnH、matK及rbcL的PCR 產物經正反方向測序后，利用MEGA7.0 軟件比對序列和分析，將所測100 份樣品石斛屬植物序列和Genbank 數(shù)據庫下載的相關序列進行種間、種內差異分析。 結果顯示，ITS 區(qū)序列G+C 平均含量53.9%，均高于其他3 個基因；ITS、psbA-trnH、matK及rbcL基因變異位點數(shù)分別為為417、124、110、43，鑒定效率分別達到100%、92.85%、46.15%和14.28%(表5)。 在物種水平上通過BLAST1 分析，結合雙參數(shù)遺傳距離發(fā)現(xiàn)，ITS 基因在類群種間和種內差異最大，psbA-trnH次之，matK和rbcL最小。

將所測100 份樣品石斛屬植物的ITS 序列和Genbank 數(shù)據庫下載的相關序列進行系統(tǒng)進化樹分析，測序得到的不同屬石斛ITS 條形碼序列與下載的同屬石斛序列分別準確的聚在一起，同源性達99%。表明ITS 條形碼在本研究的鐵皮石斛及其他石斛屬聚類分析效果上具有準確、容易區(qū)分的特點(圖1)。 綜上，ITS基因作為石斛屬最理想的DNA 條形碼，具有明顯的優(yōu)勢。

2.2 引物探針設計及多重熒光PCR 檢測方法的建立

將比對后的ITS 區(qū)域序列作為靶基因，在可變區(qū)

設計鐵皮石斛特異性引物和TaqMan 探針(圖2)。 通過對引物濃度和探針濃度優(yōu)化，確定最佳引物混合物終濃度為5.0 μmol·L-1，總反應體系為20 μL，包括2×Taqman Master mix 10.0 μL、10.0 μmol·L-1Primer Mix 1.0 μL、2.0 μmol·L-1Probe Mix 1.0 μL、1～20 ng·μL-1DNA 模板2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。 PCR 反應最佳反應條件:95℃預變性3 min；95℃變性10 s，65℃退火35 s，40 個循環(huán)，收集信號。 待測樣本檢測結果判定:在同時進行的空白、陽性對照試驗結果正常的情況下，被檢測樣品應有相應熒光信號檢出，且相應熒光通道出現(xiàn)明顯的擴增曲線，Ct 值≤35，說明DNA 提取有效。

表5 ITS、psbA-trnH、matK 及rbcL 序列信息Table 5 ITS， psbA-trnH， matK and rbcL sequence information

圖1 基于ITS 序列構建的石斛屬及近緣物種NJ 進化樹Fig.1 NJ tree based on ITS sequences from D. officinale and its closely related species

圖2 鐵皮石斛引物和探針設計Fig.2 Design the primers and probe of D. officinale

2.3 多重熒光PCR 特異性試驗

按照2.2 的方法針對鐵皮石斛的引物和特異性探針進行特異性驗證，當羧基熒光素FAM 和羅丹染料ROX 熒光修飾探針有擴增曲線時，且滿足Ct 值≤35說明檢出鐵皮石斛成分(圖3)；當只有ROX 熒光修飾探針有擴增曲線時，且滿足Ct 值≤35 說明未檢出鐵皮石斛成分(圖4)。 表6 中特異性試驗結果進一步說明鐵皮石斛的引物與探針具有很好的特異性。

圖3 鐵皮石斛探針特異性擴增曲線圖Fig.3 The specific amplification curve of D. officinale

2.4 多重實時熒光PCR 靈敏度測試

按照優(yōu)化后的反應體系，將野生鐵皮石斛基因組DNA 濃度定量到5 ng·μL-1，按照5 倍梯度稀釋，共稀釋6 個梯度，每個梯度做3 個重復，模板量取2 μL，6個梯度的模板量由高到低依次為10、2、0.4、0.08、0.016 和0.003 2 ng，進行實時熒光定量PCR 檢測。結果顯示，本方法的檢測限可達到0.016 ng(圖5)，較傳統(tǒng)凝膠PCR 凝膠電泳檢測靈敏度高很多(圖6)，說明本方法具有很高的靈敏度。

2.5 驗證試驗

使用優(yōu)化后的多重實時熒光PCR 檢測體系進行實際樣品測試，檢測結果顯示，實際樣品有5 份均為鐵皮石斛，14 份檢出非鐵皮石斛源性成分(表7)。 可見，該結果與測序結果一致，可準確檢測出鐵皮石斛源性成分，方法具有準確性和可行性。

表6 鐵皮石斛引物及探針特異性試驗Table 6 Primers and probe specificity test of Dendrobium officinale

圖4 其他石斛屬植物探針特異性擴增曲線圖Fig.4 The specific amplification curve of Dendrobium species

3 討論

近年來，由于植物葉綠體基因組具有結構簡單、相對保守，易擴增和測序的特點，常用于屬間的分類群研究。 目前，在石斛屬鑒定研究方面，作為DNA 條形碼應用較廣泛的有ITS、ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH等基因。 不同的條形碼在不同石斛屬植物中的鑒定效率不同，Asahina 等[29]研究認為matK在石斛屬的鑒別中優(yōu)于其他條形碼，更易將各個種的生物鑒別出來；付濤等[19]報道用matK+rbcL搭配petA-psbJ作為鐵皮石斛種質資源分子鑒定的條形碼組合。 因此，篩選合適的條形碼作為靶基因對于鑒定研究顯得尤為重要。 本研究根據前人的報道，選出DNA 條形碼中常用的ITS、psbA-trnH、matK和rbcL4 個基因，分別分析其在供試石斛屬樣品的種間、種內差異以及鑒定效率、進化關系，篩選出ITS 基因為鑒定石斛屬最理想的DNA 條形碼。 這與丁小余等[30]和顧慧芬等[31]報道的結果相一致。

圖5 鐵皮石斛特異引物和探針靈敏度擴增曲線圖Fig.5 The sensitivity amplification curve of specific primers and prober for D. officinale

表7 實際樣本檢測結果Table 7 The result of actual samples test

圖6 鐵皮石斛普通PCR 凝膠電泳Fig.6 General PCR gel electrophoresis of Dendrobium species

隨著實時熒光定量PCR 技術的快速發(fā)展，該技術也被應用到石斛屬的鑒定研究中。 Xu 等[32]曾將實時熒光定量PCR 技術(SYBR Green Ⅰ)與ARMS 技術相結合，對25 種石斛屬植物的鮮樣和楓斗進行了研究。Dong 等[33]也利用熒光定量技術建立了熒光熔解曲線分型方法用于石斛的研究。 本研究首次應用實時熒光定量PCR 中的TaqMan 探針法，以ITS為靶基因，利用其存在的多態(tài)性，在保守區(qū)設計出石斛屬通用引物和探針，可變區(qū)設計鐵皮石斛特異性引物和特異探針。通用探針對整個PCR 反應起到了質量控制的作用，使有石斛屬成分的樣品能被檢測出熒光信號，從而排除了假陽性的存在，而鐵皮石斛的特異引物和探針，保證了僅有鐵皮石斛石斛源性成分的信號被檢測出來。

近年來諸多研究表明DNA 條形碼在區(qū)別種內、種間以及親緣關系的鑒別方面起到了重要作用，將其作為靶基因具有可靠性。 但針對使用單一DNA 條形碼鑒別存在的假陽性問題，實時熒光定量PCR 中的TaqMan 探針法具有特異性強、準確性和靈敏度高(高出普通PCR 檢測限100 倍)、重復性好且高效經濟的獨特優(yōu)勢，其在鐵皮石斛鑒定中的應用不僅彌補了該缺陷，同時節(jié)省了測序的時間和費用。 該方法的應用不僅為鐵皮石斛新品種的鑒定和種質資源的利用與保護提供了科學依據，而且將對鐵皮石斛的臨床療效和用藥安全起到保駕護航的作用。

4 結論

本研究探討了DNA 條形碼與TaqMan 探針法在鐵皮石斛鑒定中的應用，以ITS 序列作為靶基因，利用實時熒光定量PCR 技術，建立鐵皮石斛多重實時熒光PCR 檢測新方法，該方法可對鐵皮石斛進行準確、高效地鑒定。