沈 霞 侯瀟棐 李永霞 徐阿生 楊小林

(西藏農(nóng)牧學院 資源與環(huán)境學院,西藏 林芝 860000)

楊樹(Populusspp.)是三大速生樹種之一,廣泛投入于工業(yè)造紙,家具制作等市場應用中,但是,楊屬中有些樹種,例如白楊派樹種,屬于難生根樹種,常規(guī)的繁育手段不能滿足其大量的繁殖。隨著科學技術的發(fā)展,植物組織培養(yǎng)成為解決苗木大量繁育的主要手段,楊樹的離體再生也受到極大地關注和應用[1-5]

植物組織培養(yǎng)獲得完整植株有兩種途徑:一是采用離體器官,如,帶腋芽的莖段或植物葉片直接分化培養(yǎng)獲得的不定芽,進而培養(yǎng)成完整植株的過程；二是由愈傷組織再分化產(chǎn)生不定芽,再獲得完整植株。

銀白楊(Populusalba),落葉喬木,樹形高大,樹葉銀白且背面密被絨毛,喜光,耐寒耐旱、不耐蔭[6],廣泛分布于我國東北、華北、西南、西北等地,也是青藏高原和黃土高原用以防風固沙的主要造林樹種之一[7]。銀白楊在西藏主要分布于拉薩、林芝、山南等地,是西藏“一江兩河”流域的主要栽培樹種。銀白楊應用廣泛,但傳統(tǒng)的繁育方式,如扦插等,難以使其生根成活[8],不能滿足市場的大量需求,也限制了這一優(yōu)良樹種的推廣和應用。為解決銀白楊難以大量繁殖及市場供不應求的問題,發(fā)展銀白楊的組織培養(yǎng)技術已是大勢所趨。李慧等[9]利用銀白楊的葉片作為外植體誘導不定芽的再生；李穎[10]曾利用銀白楊的休眠芽作為實驗材料進行離體再生研究；張綺紋等[11]做了銀白楊雜交樹種的組織培養(yǎng)。本文就銀白楊組織培養(yǎng)中誘導不定芽再生與增殖分化做了初步研究,希望能為西藏地區(qū)銀白楊的組培快繁的推廣提供重要的科學依據(jù)和技術支撐。

1 銀白楊不定芽誘導材料篩選

1.1 試驗材料

銀白楊供試材料取自于西藏農(nóng)牧學院林學實驗基地,長勢優(yōu)良,且?guī)в卸鄠€飽滿腋芽的1a生嫩枝。

1.2 試驗方法

1.2.1銀白楊培養(yǎng)材料篩選

1) 莖段不定芽誘導分化

以銀白楊當年生嫩枝上帶一個腋芽的莖段為外植體,以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基；添加不同種類及不同濃度激素6-芐氨基嘌呤(6-BA):0.1,0.3,0.5mg/L 等3個水平；萘乙酸(NAA):0.1,0.3,0.5mg/L 等3個水平,共9組試驗,將處理好的莖段接種在不同激素濃度的培養(yǎng)基上,每種處理接種30個外植體,3次重復,每5d觀察1次,30d后統(tǒng)計莖段不定芽誘導率。濃度配比如表1所示。

表1 莖段誘導不定芽激素濃度配比Tab.1 Stem segment induced adventitious bud hormone concentration ratio mg/L

(續(xù)表)

處理號激素種類濃度6-BANAA60.30.570.50.180.50.390.50.5

2) 葉片不定芽再生誘導

分別選擇銀白楊成熟母樹上的葉片和經(jīng)莖段,誘導不定芽獲得的組培苗葉片。在無菌條件下,將葉片切成0.5cm2大小,在葉脈上劃2～3刀,葉面向上平放于培養(yǎng)基上。葉片誘導不定芽,以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同激素濃度,6-BA分別設置:0.5,1.0,1.5 mg/L 等3個水平；NAA分別設置:0.05,0.1,0.2mg/L 等3個水平,利用正交實驗設計,共9組,每1處理接種30個外植體,3次重復。接種后,每5d觀察1次,30d后統(tǒng)計出芽數(shù),計算分化率。

1.2.2愈傷組織不定芽誘導

在莖段和葉片誘導不定芽過程中,會產(chǎn)生大量的愈傷組織。為獲得大量的不定芽,在無菌條件下,將分化出的愈傷組織切塊后接種在MS培養(yǎng)基中,添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA:0.5mg/L,NAA:0.1,0.2mg/L,激動素(KT):0.1,0.2,0.3mg/L對其不定芽進行誘導。利用正交實驗設計L9(34),共9個處理,每1處理接種30個外植體,3次重復。接種后,每5d觀察一次,30d后統(tǒng)計不定芽誘導情況。

1.2.3銀白楊不定芽繼代增殖培養(yǎng)

1) 不定芽增殖激素篩選

將誘導獲得的叢生芽從基部剪下,按2～3芽為一簇,接種在不定芽增殖的培養(yǎng)基上。以MS為基本培養(yǎng)基,選擇添加不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA:0.5,1.0,1.5,2.0mg/L；NAA:0.05,0.1,0.2,0.3mg/L；KT:0.05,0.1,0.2,0.3 mg/L；吲哚丁酸(IBA):0.1,0.2,0.3,0.4 mg/L,采用正交實驗設計L16(43),如表2所示,共16種處理,每種處理接種30簇叢生芽,3次重復,每5d觀察并統(tǒng)計1次,30d后觀察不定芽的增殖系數(shù)及不定芽生長情況。

表2 不定芽增殖正交試驗表Tab.2 The medium for adventition bud proliforation mg/L

2) 不定芽增殖pH篩選

將切割好的不定芽接種在篩選好的培養(yǎng)基上,pH值分別設置為5.4,5.8,6.2,6.6,6.8,記錄觀察芽的增殖情況。

2 結果與分析

2.1 銀白楊莖段不定芽誘導結果分析

如圖1(a)所示,莖段接入培養(yǎng)基7d后,7號處理腋芽開始萌動；如圖1(b)所示,10d后,腋芽開始長出,葉嫩綠細長；如圖1(c)所示,15d后,所有處理的腋芽都開始萌發(fā),莖段長出新的側枝,葉舒展,莖粗壯,由于帶腋芽莖段的腋芽處于萌動階段,所以,分化時間快。對不同激素種類及濃度處理的莖段不定芽誘導情況統(tǒng)計如表3所示。

圖1 莖段誘導不定芽Fig.1 Adventitious buds induced by stem segments

表3 莖段誘導不定芽數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果
Tab.3 Stem segment induced adventitious bud data statistical results

處理莖段誘導不定芽激素濃度處理號123456789重復133.3026.7020.0060.0043.3036.7090.0076.7056.70重復236.7030.0023.3056.7050.0030.0086.7083.3053.30重復330.0026.7026.7050.0040.0036.7080.0070.0066.70

對表3莖段不定芽的誘導結果進行方差分析,結果如表4所示,整個模型的F值為61.06,概率水平為0.00,其中,6-BA與NAA濃度的概率水平都為0.00,小于0.05,說明這兩種激素濃度對不定芽的誘導率影響差異顯著。

表4 莖段誘導不定芽方差分析Tab.4 Analysis of variance of induced shoot buds in stem segments

注:aR2=0.964(調(diào)整R2=0.949)。

為篩選出莖段不定芽誘導的最優(yōu)激素濃度,對6-BA 與NAA各濃度階段進行多重比較,分析結果如圖2、圖3所示。

由圖2、圖3可以看出,6-BA濃度為0.5mg/L時,莖段不定芽平均分化率達到最大,且與其他濃度處理差異顯著；NAA濃度為0.1mg/L時,不定芽分化率最高。結合統(tǒng)計結果來看,6-BA與NAA兩種激素濃度混合使用時,6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)為銀白楊莖段誘導不定芽的最優(yōu)激素濃度組合。

圖2 6-BA各濃度莖段不定芽分化Fig.2 Adventitious bud differentiation of stem segments

圖3 NAA各濃度莖段不定芽分化Fig.3 Adventitious bud differentiation of stem segments atvarious concentrationsof 6-BA at various concentrations of NAA

2.2 銀白楊葉片分化再生結果分析

在對銀白楊初代葉片和繼代葉片的不定芽過程中發(fā)現(xiàn)：初代葉片在接種后,生長初期隨培養(yǎng)時間的延長,葉片切口處有明顯的凸起和膨大增厚,切口邊緣蜷曲；10d后切口處有愈傷組織產(chǎn)生(圖4)；如圖5所示,20d后開始直接產(chǎn)生不定根,但未見不定芽產(chǎn)生；30d后基本停止生長。

繼代葉片不定芽誘導培養(yǎng)中,7d左右就有愈傷組織產(chǎn)生,15d左右開始有不定芽(圖6)和不定根,不同生長激素及含量對銀白楊葉片不定芽誘導統(tǒng)計分析如表5所示。

圖4 葉片分化愈傷組織Fig.4 Leaf differentiated callus

圖5 葉片直接生根Fig.5 Direct rooting of leaves

圖6 葉片誘導不定芽Fig.6 Adventitious buds induced by leaves

由表5可以看出,初代葉片培養(yǎng)中只有不定根產(chǎn)生,在繼代葉片不定芽誘導中,不定芽與不定根同時出現(xiàn),對于在不定芽誘導中出現(xiàn)的不定根這一結論,與陳彩霞等[12]曾在對110楊的再生研究中得出,楊樹不定芽的誘導相較不定根的誘導更難的結論相符合。

由表5可知,葉片分化率最高的激素濃度比例為6-BA∶NAA為5∶1,不論是在初代葉片出現(xiàn)的生根情況還是繼代葉片不定芽的誘導率,6-BA∶NAA=5∶1都是理想的激素比例。這與沈周高等[13-14]在對其它楊樹的研究中發(fā)現(xiàn)的6-BA與NAA的激素比例在10∶1～4∶1之間,有利于楊樹的不定芽產(chǎn)生的結果一致。誘導率最低的為9號處理,6-BA濃度為1.5mg/L,這說明在組織培養(yǎng)中,激素的使用既要考慮其濃度,也要考慮其濃度之間的比例。

表5 不同生長激素及含量對銀白楊葉片不定芽誘導的比較Tab.5 Effect of basic medium on the uncertain bud induction

注:表中同列不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

銀白楊初代葉片和繼代葉片在培養(yǎng)中出現(xiàn)的不同現(xiàn)象,與朱淑新[15]在成熟的毛白楊葉片培養(yǎng)中得出的,成熟的毛白楊葉片誘導不定芽中,只見不定根的產(chǎn)生,未見分化出不定芽的結果一致。這可能與成熟的組織材料中含有較高的IAA有關,較高的IAA可以抑制芽的分化,對生根有促進作用[16]。

2.3 愈傷組織誘導不定芽結果分析

為獲得大量的不定芽,對分化的愈傷組織進行不定芽的誘導。如圖7(a)—(c)所示,愈傷組織接種在誘導芽分化的培養(yǎng)基上,前期體積開始不斷增大,并未見不定芽產(chǎn)生,在培養(yǎng)14d左右以后,開始陸續(xù)有不定芽產(chǎn)生；培養(yǎng)30d后,愈傷組織誘導出大量不定芽,芽高2～3cm。對誘導率及不定芽再生系數(shù)進行統(tǒng)計,不同激素濃度對愈傷組織誘導不定芽分析結果如表6所示。

圖7 愈傷組織誘導的不定芽Fig.7 Adventitious buds induced by callus

表6 不同激素種類濃度對愈傷組織誘導不定芽的影響
Tab.6 Effect of different hormone concentrations on callus induced adventitious bud

處理號激素濃度/(mg/L)6-BANAAKT不定芽誘導率/%不定芽再生系數(shù)不定芽生長狀況1234560.50.10.20.158.87±2.94b9.00±1.15a叢生芽較多,較健壯0.290.00±1.91a11.00±0.58a芽多,嫩綠色,健壯0.363.33±3.84b8.33±0.88a叢生芽多,芽細高0.133.33±1.93C5.00±0.58C愈傷組織長出叢生芽,較健壯0.266.67±1.93A10.00±0.58A有新愈傷組織,芽嫩綠色,較健壯0.352.23±2.94B7.33±0.33B嫩綠色叢生芽,芽細高

注:表中小(大)寫字母表示在NAA0.1(0.2)情況下KT不同濃度對不定芽誘導影響的顯著性;同列相同字母表示差異不顯著(P>0.05),不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表6可以看出,在利用愈傷組織誘導不定芽的過程中,6-BA與NAA的單獨濃度比例為5∶1時,最有利于芽的分化。在加入KT的培養(yǎng)基中,不定芽的平均誘導率較可觀,在6-BA與NAA不同比例的培養(yǎng)基中,KT的濃度為0.2mg/L時,不定芽的誘導率與不定芽的再生系數(shù)都明顯高于其他濃度處理,在6-BA∶NAA∶KT的比例為5∶1∶2時,不定芽的誘導率為最高,達到90%,且不定芽的再生系數(shù)也為6種處理中最高的。綜合各種因素得出MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+KT(0.2mg/L)為愈傷組織不定芽誘導最適宜的培養(yǎng)基。

2.4 不定芽增殖結果分析

2.4.1不同激素種類及濃度對不定芽增殖的影響

將增殖培養(yǎng)的叢狀苗接種在增殖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)7d后,少有幼芽產(chǎn)生,增殖芽苗開始長高；培養(yǎng)15d左右,開始有新的不定芽產(chǎn)生；30d后基本停止增殖。統(tǒng)計結果如表7所示。

對不定芽增殖系數(shù)(表7)進行方差分析,結果如表8所示,不同激素對不定芽的增殖系數(shù)都存在顯著差異的影響。

表7 不定芽增殖系數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果Tab.7 Statistical results of adventitious bud multiplication coefficient data

表8 不定芽增殖系數(shù)的方差分析Tab.8 Analysis of variance of adventitious bud proliferation coefficient

注:aR2=0.990(調(diào)整R2=0.986)。

由表8看出,不同激素對不定芽增殖影響差異顯著,要篩選出最佳的激素濃度,需要對不同激素的不同水平進行多重比較,分析結果如表9所示。

表9 不定芽增殖系數(shù)多重比較Tab.9 Multiple comparisons of adventitious bud multiplication coefficients

注:表中同列不同小寫字母表示在(P<0.05)水平上差異顯著,相同字母表示在(P<0.05)水平上差異不顯著。

由表9可以看出,6-BA各濃度水平中,1.0mg/L與其他濃度差異顯著,且平均增殖系數(shù)最高,為6.19,明顯高于其他水平,因此,在不定芽增殖中,6-BA的最佳濃度為1.0mg/L。 NAA各水平之間的差異均顯著,根據(jù)平均值的大小,0.2mg/L為不定芽增殖的最佳NAA濃度。 KT各濃度之間的差異水平為0.2mg/L與其他濃度的平均值都有顯著差異,且不定芽增殖系數(shù)最高,為4.80,所以,在不定芽的增殖試驗中，KT的最佳濃度為0.2mg/L。IBA不同濃度之間的差異水平為0.2mg/L與0.3mg/L之間的差異不顯著,但均與0.1mg/L,0.4mg/L差異顯著,0.1mg/L與0.4mg/L之間差異顯著,根據(jù)增殖系數(shù)的平均值大小來看0.2mg/L的不定芽平均增殖系數(shù)最大,因此,認為不定芽增殖中IBA的最佳濃度為0.2mg/L。綜合所有因素考慮,銀白楊不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)+KT(0.2mg/L)+IBA(0.2mg/L)。

2.4.2pH值對不定芽增殖的影響

由圖8可以看出,pH對不定芽的增殖也有一定的影響,pH在5.8時,增殖系數(shù)達到最高,且與其他pH值的平均增殖系數(shù)都有顯著差異。pH在5.4和6.8時,平均增殖系數(shù)較低,無顯著差異,均與pH5.8,6.2,6.6平均增殖系數(shù)差異顯著。因此,認為在銀白楊不定芽增殖中,pH值調(diào)至5.8左右即可。

注:圖中不同小寫字母表示在(P<0.05)水平上差異顯著,相同字母表示在(P<0.05)水平上差異不顯著。

圖8 pH值對不定芽增殖系數(shù)的影響

Fig.8 Effect of pH value on adventitious bud proliferation coefficient

3 討論與結論

1) 在對兩種不同離體材料的不定芽誘導中,MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)為不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基。試驗表明：由于帶腋芽莖段,其腋芽處于萌動階段,且莖段中含有的營養(yǎng)物質較高；相對其他培養(yǎng)材料,不定芽分化所需時間短,誘導率較高,且利用帶腋芽莖段誘導不定芽程序簡單,屬于不定芽直接萌發(fā),沒有育苗風險,有基于此,莖段為不定芽誘導的最佳材料。

2) 對愈傷組織進行不定芽的誘導,結果顯示：在6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)加入激動素KT愈傷組織不定芽誘導率可觀,在KT的濃度為0.2mg/L時,愈傷組織不定芽誘導率最高。

3) 繼代增殖是植物組織培養(yǎng)中獲得大量培養(yǎng)材料的重要手段,也是組培快繁獲得大量苗木的關鍵,本試驗銀白楊不定芽增殖分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)+KT(0.2mg/L)+IBA(0.2mg/L),且分化出的芽體顏色健康,莖粗壯。培養(yǎng)基的pH值對不定芽的增殖也有顯著的影響,一般認為木本植物的pH值在5.6～6.0之間,本試驗得出,pH5.8為銀白楊不定芽增殖的最適宜的pH值。

4) 影響銀白楊不定芽誘導的因素不是單一的,是多因素交互影響產(chǎn)生的結果,帶腋芽莖段為銀白楊不定芽直接誘導的最佳外植體,這與大多數(shù)楊樹研究結果一致[17]。這種情況可能與植物體內(nèi)不同部位內(nèi)源激素的分布有關[18-19]。在對不同幼化程度的銀白楊的葉片進行不定芽誘導的過程得出,經(jīng)繼代培養(yǎng)的銀白楊葉片的分化率高于初代培養(yǎng)的銀白楊葉片。有研究表明,幼化的培養(yǎng)材料中所含的內(nèi)源激素的濃度發(fā)生變化,對再分化率有影響[20]。

培養(yǎng)基中的激素種類及濃度的不同,影響外植體的分化和生長的能力[21-22],配合使用激素,使其之間的生物學效應互補[23]。在植物組織培養(yǎng)中,對芽的分化與增殖,多采用高濃度的細胞分裂素6-BA[24-26],試驗證明,過高的細胞分裂素會抑制不定芽的分化。所以,在考慮植物生長調(diào)節(jié)劑對植物分化的影響時,要同時考慮激素濃度與濃度比例對植物分化的影響[27]。

本文在對銀白楊不定芽的誘導與增值研究中,僅針對不同材料的不定芽誘導,不同激素種類濃度對不定芽誘導與增殖,pH值對不定芽增殖的影響。在試驗過程中的蔗糖固定為30g/L、瓊脂固定為6g/L,沒有對培養(yǎng)條件進行對比篩選,后期會進行更深層次的探究。