劉璐琪，石天磊，申艷紅，武軍凱，王海靜，張立彬

(河北科技師范學院園藝科技學院，河北 秦皇島，066000)

桃(Prunuspersica(L.)Batsch)原產中國，是薔薇科中重要果樹之一，也是中國最古老的經濟果樹之一，在我國栽培歷史悠久，種植面積大，分布廣泛[1]。但是，桃果實采后迅速軟化、腐爛變質，影響其銷售與貯運[2]。尤其是有些桃品種出現(xiàn)縫合線處局部變軟的現(xiàn)象，嚴重影響經濟效益，若提前采摘又會影響果實品質。果實軟化過程中質地的變化主要是果膠降解導致細胞壁的降解，同時也與纖維素和半纖維素的結構變化有關[3]。其中，果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)在果實軟化中起著關鍵作用，它主要存在于高等植物以及一些細胞壁降解的微生物中，屬于水解酶類，是一種糖蛋白，能水解水溶性果膠分子中甲氧基(-OCH2)與半乳糖醛酸之間的酯鍵，從而形成果膠酸和甲醇，再經過PG(Polygalacturonase)作用形成游離的半乳糖醛酸[4,5]。目前，在番茄[6]、菠蘿蜜[7]、柑橘[8]、樹莓[9]、杏[10]和櫻桃番茄[11]等果實中都已證明PME對果實軟化的作用。同時許多研究表明，一些PMEs基因表達不受空間、時間的影響，在植株的整個生命歷程中均持續(xù)表達[12]，另一些則只在根發(fā)育時期、莖伸長時期、果實成熟時期或花芽和花粉管等器官組織中特異性表達[13～16]。為探討PpPME48基因與桃果實縫合線部位軟化的相關性，筆者試驗克隆桃PpPME48基因并分析其在不同品種、不同部位中的表達特性，旨在為研究PpPME48基因在桃軟化方面的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本課題組發(fā)現(xiàn)撫寧區(qū)代莊村的北京2號突變體枝條所結果實比野生型枝條所結果實晚熟，且縫合線處果肉易變軟。各取3個果，切取其縫合線和對應果面的果肉，取樣后用液氮快速冷凍，置-80 ℃保存。共得到4個樣品：分別記為WSP(野生型縫合線果肉)、WP(野生型果面果肉)、MSP(突變體縫合線果肉)、MP(突變體果面果肉)，送廣州基迪奧生物公司進行轉錄組測序。

采用桃品種燕紅和晚久保進行驗證，燕紅縫合線處易變軟，晚久?？p合線處不易變軟。這2個桃品種采摘于秦皇島市昌黎縣兩山鄉(xiāng)種植園，在果實八成熟時，采收大小一致，無病蟲害的果實置于25 ℃室溫下貯藏。在采收后當天、第3天、第5天選取3個果實分別切取縫合線和果面部位果肉，分別切碎混勻，于液氮中迅速冷凍，置-80 ℃低溫保存。燕紅與晚久保共獲得以下12份樣品：LF1與WF1，LF2與WF2，LF3與WF3，分別為燕紅與晚久保采收當天、第3天與第5天縫合線果肉；LG1與WG1，LG2與WG2，LG3與WG3，分別為采收當天、第3天與第5天果面果肉。這些樣品用于RNA的提取及熒光定量PCR進行基因表達定量分析。

1.2 方法

1.2.1桃PpPME48基因的克隆 按照植物RNA提取試劑盒(博邁德生物)說明書提取燕紅果肉總RNA，使用超微量分光光度計(BioDrop)檢測濃度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，按照Invitrogen GenRacerTMKit試劑盒說明書進行反轉錄，以桃果肉RNA(1 000 ng)為模板得到雙鏈 cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

在測得的桃轉錄組數(shù)據(jù)中檢測到PME基因家族17個基因成員，在桃基因組中找到PpPME48基因序列，利用DNAMAN軟件在該序列兩端設計一對引物，PME48-F：5′-CCCTTCCCATCCATCAATC-3′；PME48-R：5′-CTGCAGAACCGGC TTTGTTA-3′。由中美泰和生物技術(北京)有限公司合成引物。以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為20 μL：10×ExBuffer：2 μL，dNTP：1.5 μL，ExTaq酶：0.1 μL，cDNA：1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O：14.4 μL。擴增程序為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，循環(huán)34次，72 ℃延伸10 min。反應結束后用質量濃度為12.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化目的條帶，回收產物與PMD19-T vector載體連接，轉化Super DH5α感受態(tài)細胞，將轉化產物均勻涂到加氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14 h，挑取單菌落進行菌液PCR驗證，隨機挑選3個陽性克隆進行測序。

1.2.2生物信息學分析 利用DNAMAN軟件進行蛋白質翻譯和同源序列分析，利用NCBI Blastp搜索同源基因和蛋白序列；利用MEGA 5.10軟件的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建分子進化樹；利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)等在線工具進行氨基酸基本理化性質、信號肽、跨膜結構預測；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)網(wǎng)站對蛋白的保守結構域進行預測；利用Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在線進行亞細胞定位預測;利用SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)分別進行蛋白質二級結構和三級結構分析。

1.2.3桃PpPME48基因的表達分析 利用DNAMAN軟件在PpPME48基因的非保守區(qū)設計實時熒光定量引物，RT-PME48-F:5′-CACTCTGAGCGCGACAAG-3′；RT-PME48-R:5′-CCGATGAAGAAGCAAAGCC-3′。引物合成由中美泰和生物技術(北京)有限公司完成。提取采后不同時期燕紅和晚久保縫合線及果面部位的果肉RNA，分別將其逆轉錄為cDNA，然后以稀釋1倍的cDNA作為RT-qPCR的模板，使用購自美國伯樂(Bio-Rad)有限公司的Bio-Rad CF CONNECTTMReal-Time System熒光定量PCR儀檢測基因的表達量。參考佟兆國[17]篩選的桃內參基因TEF2設計熒光定量PCR引物，TEF2-F：5′-GGTGTGACGATGAAGAGTGATG-3′；TEF2-R：5′-TGAAGGAGAGGGA AGGTGAAAG-3′。RT-qPCR反應體系為10 μL體系：SYBR Mix：5 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA：1 μL，ddH2O：2 μL。兩步法擴增：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，39次循環(huán)。采用相對定量2-ΔΔCt法[18]進行3次生物學重復測定，然后利用Excel軟件對實驗結果統(tǒng)計分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取

分別提取燕紅和晚久保在采后當天、第3天和第5天的縫合線和果面處果肉提取RNA，超微量分光光度計(BioDrop)檢測OD260/OD280比值均在2.0以上，表明提取的RNA無降解，質量濃度為10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖1，RNA條帶清晰無彌散，28 s RNA條帶亮度約為18 s RNA條帶的2倍，檢測結果說明所提RNA質量良好可以進行后續(xù)試驗。

2.2 桃PpPME48基因的篩選和克隆

將從實驗室已完成的桃轉錄組測序數(shù)據(jù)庫篩選出15個差異表達基因進行熒光定量PCR驗證(圖2)。15個差異基因的表達趨勢均與轉錄組數(shù)據(jù)一致，這證明了轉錄組數(shù)據(jù)的可靠性。從轉錄組數(shù)據(jù)庫中檢測到24個的PME基因，表達量見表1，刪除部分部位表達量為0的基因，剩下17個PME基因進行熱圖分析，結果發(fā)現(xiàn)，其中基因PpPME48在野生型縫合線(WSP)表達量高于野生型果面(WP)(圖3)，同時突變體縫合線(MSP)表達量也遠高于突變體果肉(MP)中的表達量，在突變體中MSP和MP之間相差倍數(shù)高達13倍，因此選擇該基因為桃軟化相關的候選基因并做進一步研究。

以燕紅果肉cDNA為模板，PME48-F和PME48-R為引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)條帶在1 000 bp以上，與預期目的基因大小一致(圖4)。用膠回收試劑盒回收目的條帶，將回收產物和PMD19T載體連接，經轉化后，挑取單克隆菌落8個，進行菌液PCR檢測，有7個菌落擴增出特異性條帶且條帶大小約1 200 bp，PpPME48基因的克隆陽性率達到87%，在陽性克隆中隨機挑選3個送中美泰和公司進行測序。測序長1 278 bp，與已知差異片段重疊，發(fā)現(xiàn)有4個堿基差異。將其命名為PpPME48，GenBank登錄號為MT019687。

表1 PME基因表達量

圖2 RT-qPCR轉錄組數(shù)據(jù)驗證

圖3 桃果實轉錄組中PME熱圖分析

圖4 PpPME48基因的PCR擴增產物(M:DL2000)

2.3 桃PpPME48基因編碼的蛋白結構分析

桃PpPME48基因編碼370個氨基酸。通過ProtParam分析可知，桃PpPME48蛋白質分子量為41 187.06 ku，分子式C1 856H2 860N500O533S15，理論等電點為8.79，PpPME48蛋白總的負電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)為37個，正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)為43個。該蛋白由20種氨基酸構成，其中丙氨酸所占比例最大(8.1%)，半胱氨酸所占比例最小(1.4%)。該蛋白脂肪系數(shù)為77.76，不穩(wěn)定指數(shù)為31.59，為穩(wěn)定蛋白；該蛋白親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.158，屬親水性蛋白。信號肽預測發(fā)現(xiàn)PpPME48蛋白有1個信號肽，為分泌蛋白，裂解位點的位置在27和28之間。利用TMHMM在線分析結果表明，桃PpPME48蛋白不具有跨膜結構。使用Prot Comp 9.0在線軟件進行亞細胞定位預測分析可知，桃PpPME48蛋白主要位于細胞外基質。利用SMART對其編碼蛋白的保守結構域進行分析，表明PpPME48蛋白包含1個果膠甲酯酶結構域，位于氨基酸的75～361位點。

用SOPMA對PpPME48蛋白進行二級結構預測，其中包括21.62%的α-螺旋、6.76%的β-轉角、30.81%的延伸鏈和40.81%的無規(guī)則卷曲，且其中所占比例最高的為無規(guī)則卷曲。通過SWISS-MODEL在線分析工具進行三級結構預測，結果見圖5?？梢钥闯觯c二級結構預測的α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲結構相符。

2.4 桃PpPME48基因同源分析與系統(tǒng)進化分析

通過BlastP比對發(fā)現(xiàn)PpPME48基因編碼的氨基酸序列與扁桃(Prunusdulcis)、烏梅(Prunusmume)、甜櫻桃(Prunusavium)、蘋果(Malusdomestica)具有很高的同源性，序列相似程度最高，相似率分別為98.11%，96.22%，94.86%，82.79%。利用DNAMAN軟件進行同源比對，結果顯示，桃PME蛋白與其他物種PME蛋白具有相似結構域(圖6)，包括5個高度保守區(qū)：RegionⅠ(GxYxE)，RegionⅡ(QAVAxR)，RegionⅢ(QDTL)，RegionⅣ(Gxx DFIFG)，RegionⅤ(YLGRxWx)。利用MEGA5.1進行系統(tǒng)譜系分析發(fā)現(xiàn)，PpPME48與薔薇科的扁桃、烏梅和甜櫻桃親緣關系較近(圖7)。

注：紅框區(qū)域表示5個保守的結構域

圖7 PpPME48蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

圖8 PpPME48基因的表達分析

2.5 桃PpPME48基因在不同品種不同貯藏時間的表達分析

燕紅是縫合線易變軟品種，晚久保是縫合線不易軟品種。隨著果實后熟，PpPME48基因在2個品種的縫合線和果肉部位的表達趨勢都是先升高后降低，在采收后第3天表達量達到最高(圖8)。然而在燕紅中，PpPME48基因在縫合線處的表達量明顯高于果面，且在采后各時期、部位的表達亦明顯高于晚久保，這說明燕紅的縫合線變軟可能與PpPME48基因的高表達相關。

3 結論與討論

果實軟化是果實成熟標志之一，同時是一個復雜的生長發(fā)育調控過程，果實在儲藏過程中仍然不斷軟化。許多研究表明，果實軟化與果膠甲酯酶(PME)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、纖維素酶(Cellulases，CX)等密切相關，其中果膠甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性增強導致果膠等細胞壁物質降解，從而引起果實硬度下降、質地變軟。果膠甲酯酶抑制劑(Pectin methylesterase inhibitors，PMEI)抑制果膠甲酯酶去甲酯化作用，從而調控PME的活性。曾文芳等[19]在溶質型桃和硬質型桃果實成熟過程中發(fā)現(xiàn)1個PME和2個PMEI基因在溶質型桃中高表達，是研究桃果實成熟軟化的關鍵基因。Xue等[20]在草莓研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)vPME38和FvPME39在果實成熟過程中大量表達導致草莓軟化，并加速果實成熟進程。Tieman等[21]在研究番茄中發(fā)現(xiàn)，PME對果實軟化影響顯著，但是不影響果實成熟進程。因此，不同植物的PME表現(xiàn)不同功能，可能是果實發(fā)育過程的多樣性導致。同時，許多研究表明，PME的活性在不同種類、不同品種的果實中表現(xiàn)不同，起著不同作用。在蘋果中，魏建梅等[22]發(fā)現(xiàn)，在果實軟化過程中，PME的活性逐漸增加，且在不同時期不同品種中存在差異，受乙烯調控的影響。在杏中，Botondi等[23]發(fā)現(xiàn)，品種Ceccona中果膠甲基酯酶(PME)活性均呈下降趨勢，果實成熟過程中硬度不變；而在品種San Castrese中，PME活性略有升高，果實在成熟過程中變軟。在茄子中，趙云峰等[24]研究發(fā)現(xiàn)，采后果肉PME活性呈峰型變化。

果膠甲酯酶是一個龐大的基因家族，在植物中檢測到多種PME同工異構體，它們的分子量、等電點和生物化學活性都不相同[25]。霍如雪等[26]在桃PME基因家族中鑒定出69個PME蛋白，按照基因和蛋白的結構分為TypeⅠ，TypeⅡ兩類。Type Ⅱ類PME蛋白具有1個比較長的N-端PRO區(qū)域，而TypeⅠ類PME蛋白的PRO區(qū)域很短甚至缺失，PpPME48具有1個比較長的PRO區(qū)域，屬于TypeⅡ。PpPME48全長1 113 bp，共編碼370個氨基酸，蛋白質分子量為41 187.06 ku，理論等電點為8.79，翻譯后的蛋白序列含有果膠甲酯酶的重要結構域，與扁桃(Prunusdulcis)、烏梅(Prunusmume)、甜櫻桃(Prunusavium)的PME蛋白有很高的同源性。PpPME48在北京2號桃突變體縫合線部位的表達量是其果面部位表達量的13倍，說明該基因可能參與了縫合線部位的變軟。RT-qPCR分析表明，PpPME48基因在縫合線易軟品種中表達量顯著高于不易軟品種，且在易軟品種燕紅中，PpPME48在縫合線處的表達量顯著高于果面，與轉錄組結果相符。由此可知，PpPME48基因在桃果實軟化過程中起重要作用，并且與縫合線部位的軟化密切相關。