曹伊媛，陳 穎，周 薏，張慧倩，李國文△

1.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科(上海 200082)；2.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科(上海 200082)

急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是一種非細菌性的炎性疾病，其特征是嚴重的炎癥和腺泡細胞的凋亡，是臨床常見急腹癥[1]。在中醫(yī)學范疇，AP屬于里實熱證，肝郁氣滯證為其主要證候。柴胡疏肝散(Chaihu Shugan San,CSS)為肝郁氣滯證急性胰腺炎的主方，出自于《景岳全書》，具有疏肝解郁，理氣通腑的作用，原方由“醋炒陳皮、柴胡各二錢，川芎、麩炒枳殼、芍藥各一錢半，炙甘草五分，香附一錢半”組成[2-3]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于“疾病-基因-靶點-藥物”概念的藥物研究模式，站在系統(tǒng)、綜合的角度看待藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預和影響，以揭示藥物對人類的復雜機制[4]。中醫(yī)的整體觀以及中藥復方中的多成分、多途徑和多靶點協(xié)同作用與網(wǎng)絡(luò)藥理學的系統(tǒng)性相統(tǒng)一[5]。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，建立CSS-AP-靶點互作網(wǎng)絡(luò)，詮釋CSS治療AP的可能作用機制。

材料與方法

1 材 料 中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)，PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)，PubChem數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)，DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)，TTD數(shù)據(jù)庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)，Discovery studio 3.0，STRING 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，Cytoscape 3.7.2軟件。

2 研究方法

2.1 CSS活性成分虛擬篩選：本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索CSS全方成分，口服生物利用度(OB)≥ 35%，類藥性(DL)≥ 0.2，藥物半衰期(HL) ≥8為閾值，篩選CSS中的活性成分作為候選化合物。

2.2 CSS活性成分治療AP候選預測靶點的篩選：通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集候選化合物對應(yīng)的蛋白靶標，利用TTD數(shù)據(jù)庫和DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索與AP相關(guān)的疾病蛋白。兩者的共同基因即為CSS治療AP的候選預測靶點。

2.3 基因本體論(GO)與KEGG通路富集分析：通過STRING數(shù)據(jù)庫對候選預測靶點進行GO和KEGG信號通路富集分析。通過錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)篩選出主要相關(guān)的生物學功能和信號通路。

2.4 分子對接及“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)互作圖：利用Discovery studio 3.0 軟件對候選成分和候選預測靶點進行分子對接，通過定位小分子化合物與蛋白的活性位點，找到結(jié)合最優(yōu)構(gòu)象，對受體與配體的親和力進行計算并打分。篩選出比原有小分子和靶點結(jié)合高的分數(shù)，說明此成分與該靶點親和力好。通過Cytoscape 3.7.2軟件繪制“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)互作圖。

結(jié) 果

1 CSS候選成分數(shù)據(jù)庫 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索CSS全方成分，通過設(shè)置OB、DL、HL閾值，篩選出54個化學成分。檢索文獻中報道較多的成分[5]，分別為柴胡皂苷A、柴胡皂苷B、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I、川芎嗪、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸、甘草次酸、甘草素。納入其中，整理所得共68個活性化合物，即為CSS的候選活性化合物。見表1。

表1 CSS 活性化合物信息

2 AP候選預測靶點的篩選 通過TCMSP收集68個活性化合物對應(yīng)靶點，去重得到249個蛋白靶標，與TTD數(shù)據(jù)庫和DrugBank數(shù)據(jù)庫去重所得354個蛋白靶標進行比對取交集，利用韋恩圖展示疾病靶點與成分靶點之間交集情況(圖1)，紅色代表AP靶點，綠色代表CSS靶點，重疊部分為共同靶點。共得到25個交集靶點，分別為PRKCA、PPARG、PTGS1、PTGS2、MAPK14、MAPK8、MAPK1、MAPK10、GSK3B、PTGES、MDM2、APP、CASP3、CASP7、IL6、ACHE、BCL2、BCL2L1、IKBKB、AKT1、CHEK2、HMOX1、VEGFA、MCL1、RAF1，用于后續(xù)網(wǎng)絡(luò)藥理學分析。

圖1 CSS-AP共同基因靶點圖

3 GO與KEGG富集分析 將25個預測蛋白導入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選Homo sapiens，為提高確率，置信度設(shè)置為0.9，共包含25個節(jié)點，46條邊的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)(圖2)。同時，對預測蛋白進行GO分析，選取FDR排名前10名的條目建立柱狀圖(圖3)，藍色為生物過程，粉色為細胞組成，黃色為分子功能。對預測蛋白進行KEGG通路分析并采用Cytoscape軟件展示FDR前20名的通路的蛋白富集情況(圖4)，結(jié)果顯示，蛋白較多富集在癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、細胞凋亡信號通路、AGE-RAGE信號通路和TNF信號通路等，說明CSS的活性成分可通過這些通路來干預急性胰腺炎。

圖2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)

圖3 FDR前10名GO分析

圖4 FDR前20名蛋白-通路關(guān)系圖

4 分子對接及“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)互作圖 應(yīng)用Discovery Studio軟件對68個候選成分和25個預測靶點進行虛擬對接。甘草作為使藥，起調(diào)和諸藥作用，故只篩選分子對接結(jié)果較好的三個成分甘草苷、光甘草寧、甘草寧H，利用Cytoscape可視化，對31個成分和25個蛋白靶標作成分-蛋白關(guān)系互作圖(圖5)。共有56個節(jié)點和289條邊，其中，對接較好的活性成分為柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、葉酸、柚皮苷、橙皮苷和甘草苷分別能與18、18、20、20、18、17個蛋白對接成功。柴胡皂苷C和柴胡皂苷D為柴胡的主要成分，葉酸為川芎的活性成分，柚皮苷為枳殼成分，橙皮苷為陳皮成分，甘草苷為甘草成分。BCL2L1、PTGS2、MCL1、RAF1、IL-6、AKT1在對接結(jié)果中與較多成分顯示出親和力，分別能與60、47、45、44、41、40個成分對接成功，為CSS治療AP中較重要的靶點。

圖5 31個成分和25個蛋白靶標成分-蛋白關(guān)系圖

討 論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)對CSS治療AP的作用機制進行了較系統(tǒng)地分析。由分子對接我們可以看到CSS對AP涉及的蛋白靶標主要有BCL2L1、PTGS2、MCL1、RAF1、IL-6、AKT1等。PTGS2參與了急性胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展，重癥急性胰腺炎時PTGS2顯示高表達[9-10]。抑凋亡細胞MCL1可抑制胰腺導管上皮細胞凋亡，在急性胰腺炎后期組織愈合過程中起主要作用[11]?？寡趸?，抗炎和抗凋亡特性可有效改善急性胰腺炎的癥狀，BCL2L1是重要的抗凋亡分子。在AP發(fā)展過程中，IL-6上調(diào)可導致嚴重的炎癥反應(yīng)，AKT1則與控制腺泡細胞增殖和腺泡向?qū)Ч芑芮邢嚓P(guān)[12-13]。

AP的發(fā)病與炎性和細胞凋亡密不可分，輕癥急性胰腺炎中細胞凋亡現(xiàn)象廣泛存在[14]。柴胡皂苷具有誘導癌細胞分化和凋亡，抑制細胞生長的特性[15]。Lee等[16]發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷C可有效抑制細菌脂多糖誘導的凋亡細胞死亡，而細菌脂多糖為炎癥的重要介質(zhì)可用來觀察AP的病程，柴胡皂苷D可降低炎癥因子IL-6的表達[17]。葉酸是一類人體必需的B族維生素，在人體代謝循環(huán)，細胞生長、分化、修復和宿主防御等方面扮演重要角色。CSS中的橙皮苷、柚皮苷、甘草苷作為黃酮類化合物同樣具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，在臨床可用來治療病原微生物引起的炎癥疾病及膿腫潰瘍等疾病[18]。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)CSS可能作用于BCL2L1、PTGS2、MCL1、RAF1、IL-6、AKT1等多個靶點，通過癌癥、PI3K-Akt、細胞凋亡、AGE-RAGE等信號通路來調(diào)控炎癥、細胞凋亡及免疫水平。柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、葉酸、柚皮苷、橙皮苷和甘草苷很可能是CSS主要的多效活性化合物。該研究為深入探討CSS治療AP的作用機制提供了新思路。