惠建榮，羊 璞，趙 嫻 ，龐苗苗，惠建安，王院春

1.陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院(咸陽712046)；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(咸陽712000)；3.武警陜西省總隊醫(yī)院(西安710054)；4.陜西省富平縣第二人民醫(yī)院(富平714000)

缺血性腦血管病(Ischemic cerebral vascular disease,ICVD)是腦內血管阻塞引起的局部腦血流量減少，缺血中心區(qū)域細胞處于缺血缺氧狀態(tài)，從而導致細胞大量凋亡，神經組織缺損的一種疾病，包含兩種類型為缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作，其中最常見的為腦卒中，約占所有缺血性腦血管病的86%，具有高發(fā)病率、高致殘率、高復發(fā)率和高死亡率的特點，嚴重危害人類的健康和生活質量。據報道，腦血管病(又稱卒中)是近年導致我國公民死亡的主要原因之一[1]。根據流行病學調查結果顯示，我國每年有150萬～200萬新發(fā)腦血管病的病例，現(xiàn)有腦血管病患者700余萬人，其中約70%為缺血性腦血管病[2]。針灸治療缺血性腦卒中已經得到證實與推廣[3]。本研究選用百會、大椎，從分子水平研究針刺促腦缺血后神經再生的作用機制，探討針刺對腦缺血大鼠腦內神經再生相關信號GAP-43蛋白的影響，為深入研究腦缺血后神經再生的治療方法奠定基礎。

材料及方法

1 材料選取及針刺取穴方法 選取健康成年SPF級雄性SD大鼠150只，體重230～270 g，由西安交通大學醫(yī)學動物中心提供。針刺取穴：百會(DU20)、大椎(DU14)，定位參考照大鼠的常用針灸穴位：“百會”位于頂骨正中,“大椎”在第7頸椎與第1胸椎間，背部正中。以1寸毫針(0.3 mm×25 mm)向后平刺百會0.5寸，直刺大椎0.3寸。

2 模型制備 采用栓線法制作大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，將大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉(劑量為0.35 ml/100 g)后仰臥固定在手術臺上。切開大鼠頸部正中皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，分別分離左側頸總動脈及頸外動脈、頸內動脈，將魚線線栓頭用硅膠包裹，用制備好的魚線沿頸外動脈插至頸內動脈。動物清醒后采用Bederson法進行神經功能缺損評分，評分1～3分者為模型成功[4]。

3 分組及干預方法

3.1 模型分組：模型制備成功后按隨機區(qū)組化法分為四組:模型組、電針組、傳統(tǒng)針刺組、電針結合傳統(tǒng)針刺組，每組各30只。各組又隨機平均分為術后3 d、7 d、21 d 3個不同時段亞組，同時設立假手術組30只。

3.2 干預方法：模型組術后不予處理；電針組予針刺入穴位后電針干預，接G6805-2型電針儀，采用連續(xù)波，頻率120次/min，電流強度1 mA,輸出電壓2～4 V，以大鼠耐受且局部組織輕微顫抖為度，每天干預1次，每次干預時間為30 min[5]；針刺組予針刺干預，每次針刺入穴位后，每隔5 min捻轉行針1次，頭針頻率200次/min，體針80次/min，每天干預1次，每次留針30 min；電針結合傳統(tǒng)針刺組，行電針及傳統(tǒng)針刺方法，每日1次。假手術組30只作實驗大鼠大腦中動脈的充分暴露，不予栓線。

4 觀察指標

4.1 大鼠神經功能缺損評分：各組大鼠在造模后3 d、7 d、21 d 3個不同時段采用修正神經功能缺損評分(Neurological severity scores,NSS)對其進行神經功能評估。神經功能依據其受損程度分為0～18分，0分即為正常，18分即為最嚴重的神經功能缺失。NSS根據一系列的運動、感覺、反射及平衡試驗等進行評分。實驗動物不能完成規(guī)定的動作或者反射即給1分，因此評分越高，其神經功能損害越嚴重[5]。

4.2 腦組織的病理改變及免疫組化檢測：各組大鼠分別于3 d、7 d、21 d 3個不同時段，3個時間點隨機取10只。用6%水合氯醛腹腔內注射麻醉后固定于手術臺，剪開胸腔，仔細剪開心包膜，暴露心臟，在心尖處剪一小切口，用9#針頭插入左心室，灌注0.9%生理鹽水，剪開右心耳讓血液流出，至右心耳流出液為無色透明時開始用4%多聚甲醛灌注固定。固定后立即剖顱取腦，在視交叉處切開,冠狀切取 2 mm 厚包含梗死灶區(qū)域及左右半球的組織塊浸于4%多聚甲醛中再固定。在梗死區(qū)取約0.5 mm厚腦組織50%、75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水；二甲苯透明；浸蠟包埋；連續(xù)冠狀切片，切片厚5 μm。切片備用并進行HE染色及免疫組化染色檢查。最后 Olympus BX51顯微鏡觀察并攝片，采用JD801形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)進行分析[6]。

結 果

1 大鼠神經功能缺損評分 實驗結果見表1。假手術組大鼠各時間段神經功能未見明顯異常，評分為0分，各時間段模型組神經功能評分與假手術組比較顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在各時間段其他組與模型組比較，電針組、傳統(tǒng)針刺組、電針結合傳統(tǒng)針刺組神經功能缺損評分均較模型組降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術后第7天和第21天，與電針組、傳統(tǒng)針刺組比較，電針結合傳統(tǒng)針刺組大鼠神經功能缺損評分降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2 各組不同時點腦組織GAP-43蛋白的免疫組化表達情況 免疫組化檢測缺血周邊區(qū)GAP-43的表達情況見表2。各時間段模型組腦組織GAP-43蛋白的免疫組化表達與假手術組比較顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在各時間段其他組與模型組比較，電針組、傳統(tǒng)針刺組、電針結合傳統(tǒng)針刺組大鼠相應區(qū)域GAP-43免疫活性較模型組GAP-43免疫活性增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術后第3天、第7天和第21天，與電針組、傳統(tǒng)針刺組比較，電針結合傳統(tǒng)針刺大鼠GAP-43免疫活性顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較(分)

注：與模型組比較，△P<0.05；與電針組比較，▲P <0.05；與傳統(tǒng)針刺組比較，#P<0.05；與假手術組比較，*P<0.05

表2 各組大鼠不同時點腦組織GAP-43蛋白免疫組化表達情況比較(nmol/ml)

注：與模型組比較，△P<0.05；與電針組比較，▲P<0.05；與傳統(tǒng)針刺組比較，#P<0.05；與假手術組比較，*P<0.05

討 論

缺血性腦血管病屬于中醫(yī)“中風”范疇[7]，基本病機為氣血逆亂、腦脈痹阻或血溢于腦所致，其病位主要在腦。《難經·二十八難》云：“督脈者，起于下極之輸，并于脊里，上至風府，入屬于腦?！辈⑶叶矫}為陽脈之海，總督一身之陽，其循行入屬于腦，因此，督脈與腦的關系非常密切。“經脈所過、主治所及”，經穴具有治療其經脈所過部位臟腑、組織及聯(lián)系器官的疾病。所以督脈擅長治療神經系統(tǒng)相關疾?。贿x用督脈腧穴百會、大椎治療中風，具有通利樞機、開竅醒神、滋陰抑陽、活血化瘀、益腎補髓等作用，使功能得復。

GAP-43為神經組織特異性磷酸蛋白，表達在發(fā)育或再生軸突的生長錐末端，可促進神經細胞生長、軸突再生和突觸重構，是軸突生長分子標志蛋白，中樞神經損傷后，GAP-43在腦組織中呈現(xiàn)高表達，與神經系統(tǒng)的發(fā)育、突觸形成和可塑性以及神經再生有著密切的關系[8-10]。ICVD會嚴重損害中樞神經系統(tǒng)，眾多學者認為GAP-43是研究腦損傷修復的首選標志物之一[6,11-12]，針刺對促進ICVD后神經修復具有較好的治療作用，筆者前期采用針刺治療ICVD患者取得了較好的臨床療效[13]，但機制還不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，電針組、傳統(tǒng)針刺組、電針結合傳統(tǒng)針刺組均可促進腦缺血大鼠神經功能恢復，以及促進腦損傷周圍存活的神經元軸突末梢的GAP-43蛋白表達，且電針結合傳統(tǒng)針刺組較電針組及傳統(tǒng)針刺組的效果更佳，其作用可能是與針刺刺激能夠調節(jié)缺血區(qū)腦細胞內離子通道和離子含量有關[14-15]。因此，基于“督脈入屬于腦”理論針刺百會、大椎穴對腦缺血大鼠腦內神經再生相關信號GAP-43蛋白的表達具有提高的作用。

綜上所述，電針結合傳統(tǒng)針刺百會、大椎可以促進GAP-43陽性細胞的表達，進而改善腦缺血大鼠神經功能，促進缺血區(qū)的神經修復，可能與針刺調控細胞內離子通道和離子含量相關，促進腦神經的重塑。由此，基于“督脈入屬于腦”理論針刺百會、大椎穴可有效地提高ICVD大鼠神經再生相關信號GAP-43蛋白的表達水平，在防治ICVD上具有一定作用。