梁 凡,蘇 通,劉銅華,高 明,盛 彤,王 穎,郭翔宇△

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院(北京 100038)；2.北京市西城區(qū)月壇社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(北京 100038)；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院(北京 100078)；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)(北京 100029)；5.日本武庫(kù)川女子大學(xué)藥學(xué)部(日本兵庫(kù) 6638179)

糖尿病已經(jīng)成為對(duì)人類生命健康威脅最嚴(yán)重的疾病之一。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，目前有4.63億成人糖尿病患者分布在世界各地，其中中國(guó)的成人糖尿病患者達(dá)到了1.164億[1]。

番石榴葉是民間常用來治療糖尿病的中藥。前期研究發(fā)現(xiàn)番石榴葉提取物可以上調(diào)SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcr大鼠骨骼肌的AMPK，進(jìn)而激活下游胰島素敏感的IRS-PI3K-AKT-GLUT4信號(hào)通路改善血糖[2]。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步觀察番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠的骨骼肌AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白和脂肪組織PGC-1α、UCP-1蛋白表達(dá)的影響，探討其對(duì)骨骼肌和脂肪組織中糖代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)藥物 番石榴葉提取物由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制備。

2 動(dòng)物飼養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)共納入SPF級(jí)6周齡雄性肥胖的db/db(C57BLKS/J-m-Lepr-/-)小鼠24只以及同齡C57BL/6J雄性正常小鼠6只。所有小鼠均在北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，12 h/12 h自然晝夜光線照射，予普通飼料喂養(yǎng)，除每周檢測(cè)空腹血糖前需要禁食不禁水12 h外，小鼠均自由進(jìn)食、飲水。

3 主要試劑 血糖試劑盒購(gòu)自Bayer公司，血漿胰島素Elisa試劑盒購(gòu)自Sigma公司。AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FDNC5、UCP-1的一抗均購(gòu)自Abcam公司。二抗IgG/HRP購(gòu)自CST公司。

4 分組與給藥 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，6只C57BL/6J小鼠設(shè)為正常組，db/db小鼠檢測(cè)空腹血糖≥7 mmol/L視為造模成功，按體重查隨機(jī)數(shù)字表將db/db小鼠分為四組：模型組、番石榴葉提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組6只小鼠。根據(jù)小鼠體表面積折算每日藥物灌胃量，按低劑量組3.5 mg/kg(折算生藥材2 g/kg)、中劑量組7 mg/kg(折算生藥材4 g/kg)、高劑量組14 mg/kg(折算生藥材8 g/kg)每日灌胃番石榴葉提取物，每日灌服模型組和正常組小鼠等量蒸餾水，所有小鼠每日灌胃1次，連續(xù)干預(yù)4周。

5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

5.1 觀察小鼠一般情況：實(shí)驗(yàn)研究期間每天觀察小鼠體型、毛色、精神狀態(tài)、活動(dòng)量等一般情況，每周檢測(cè)并記錄一次進(jìn)食量和體重變化。

5.2 空腹血糖：每周檢測(cè)一次空腹血糖，采用快速血糖儀檢測(cè)小鼠尾靜脈末梢全血中的葡萄糖值，檢測(cè)前禁食不禁水12 h。

5.3 處死、取材及檢測(cè)生化指標(biāo)：番石榴葉提取物干預(yù)4周后空腹脫臼處死所有小鼠，摘除眼球取血漿400 μl，-20℃冰箱保存血漿標(biāo)本，采用Elisa血漿胰島素試劑盒按制造商使用說明檢測(cè)小鼠血漿胰島素水平。皮下脂肪、后腿腓腸肌組織的取材在冰上進(jìn)行，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

5.4 計(jì)算HOMA-IS和HOMA-IR：通過下面的公式計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(HOMA-IS)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)評(píng)估胰島素敏感性(FPG:mmol/L;FINS:μU/ml)：

5.5 Western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：采用Western-blot法檢測(cè)骨骼肌中AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白的表達(dá)和脂肪組織中PGC-1α、UCP-1蛋白的表達(dá)。

結(jié) 果

1 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠體重的影響 見表1。與正常組相比，模型組小鼠體型肥胖，體重明顯升高；番石榴葉提取物高劑量組小鼠的體重較模型組小鼠明顯下降，而中、低劑量組體重降低不明顯。

表1 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠體重的影響(g)

注：與模型組比較，*P<0.05

2 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠空腹血糖的影響 見表2。模型組小鼠血糖明顯升高；與模型組比較，db/db小鼠的血糖經(jīng)番石榴葉提取物高劑量干預(yù)4周后顯著降低。

表2 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠空腹血糖的影響(mmol/L)

注：與模型組比較，*P<0.05

3 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠血漿胰島素(INS)的影響 見表3。與正常組相比，模型組小鼠胰島素含量明顯升高；番石榴葉提取物高、中劑量組小鼠胰島素含量比模型組降低明顯。

注：與模型組比較，*P<0.05

4 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠胰島素敏感指數(shù)(HOMA-IS)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的影響 見表4。模型組小鼠胰島素敏感指數(shù)明顯降低，同時(shí)胰島素抵抗指數(shù)明顯升高；與模型組比較，番石榴葉提取物高、中劑量組小鼠胰島素敏感指數(shù)明顯升高，且番石榴葉提取物高、中、低劑量干預(yù)均使胰島素抵抗指數(shù)顯著降低。

表4 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠胰島素敏感指數(shù)和胰島素抵抗指數(shù)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

5 Western-blot檢測(cè)AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白在骨骼肌中的表達(dá) 見表5。各組小鼠骨骼肌AMPK-α蛋白表達(dá)經(jīng)比較無明顯差異；與正常組比較，模型組小鼠骨骼肌中p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白表達(dá)顯著降低；與模型組比較，番石榴葉提取物干預(yù)的小鼠p-AMPK-α、PGC-1α和FNDC5蛋白表達(dá)顯著增加(圖1)。

表5 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠骨骼肌AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白表達(dá)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

圖1 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠骨骼肌AMPK-α、p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白表達(dá)的影響

6 Western-blot檢測(cè)PGC-1α和UCP-1蛋白在脂肪組織中的表達(dá) 見表6。模型組小鼠脂肪組織中PGC-1α、UCP-1蛋白的表達(dá)較正常組均顯著降低；而在番石榴葉提取物干預(yù)的小鼠的脂肪組織中，PGC-1α和UCP-1蛋白表達(dá)均明顯升高(圖2)。

表6 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠脂肪組織PGC-1α、UCP-1蛋白表達(dá)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

圖2 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠脂肪組織PGC-1α、UCP-1蛋白表達(dá)的影響

討 論

白色脂肪組織棕色化是骨骼肌調(diào)控糖脂代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的脂肪組織主要分為白色脂肪組織(WAT)和棕色脂肪組織(BAT)。WAT的主要功能是儲(chǔ)存能量，并分泌瘦素、脂聯(lián)素等促炎細(xì)胞因子[3]；BAT則主要通過產(chǎn)熱參與基礎(chǔ)代謝和應(yīng)激能量消耗[4]。BAT雖然僅占體重的1%，但在寒冷、藥物、細(xì)胞因子等作用下可由WAT分化而來[5-6]。這個(gè)過程可由骨骼肌AMPK-PGC-1α-FNDC5信號(hào)通路介導(dǎo)。單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員[7]，廣泛存在于骨骼肌細(xì)胞中，它通過與一氧化氮(NO)相互作用，誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的線粒體合成過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)輔助活化因子1α(PGC-1α)[8]，PGC-1α通過直接作用于骨骼肌膜蛋白FNDC5來提高其表達(dá)并促進(jìn)它的修飾。Irisin是FNDC5修剪和修飾后的下游產(chǎn)物，被發(fā)現(xiàn)可以有效促進(jìn)白色脂肪組織向棕色脂肪組織分化并以熱能的形式消耗化學(xué)能[9]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10]也已證實(shí)它可以有效降低體重和改善胰島素抵抗。

番石榴葉是民間常用的降糖中藥[11]，研究表明，番石榴葉中含有黃酮類和三萜類化合物等化學(xué)成分，可以顯著降低血糖[12]。在前期研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)番石榴葉提取物可上調(diào)SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcr大鼠骨骼肌AMPK，進(jìn)而激活下游胰島素敏感的IRS-PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)改善血糖。

db/db小鼠出生4周后便開始出現(xiàn)肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等一系列糖尿病癥狀[13]。結(jié)果表明，經(jīng)過番石榴葉提取物4周的干預(yù)后，與模型組相比，高劑量組小鼠的體重、血糖明顯降低，中劑量組小鼠的血糖在第2周時(shí)也有明顯下降，高、中劑量組小鼠胰島素水平均顯著降低，胰島素敏感性增強(qiáng)。在機(jī)制研究中，番石榴葉干預(yù)后的小鼠骨骼肌p-AMPK-α、PGC-1α、FNDC5蛋白表達(dá)和脂肪PGC-1α、UCP-1蛋白表達(dá)表達(dá)均顯著提高，磷酸化AMPK-α刺激下游PGC-1α-FNDC5信號(hào)通路被激活，使FNDC5下游產(chǎn)物Irisin分泌增多，Irisin通過循環(huán)系統(tǒng)與白色脂肪細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合后，誘導(dǎo)BAT的分化并抑制WAT的形成，刺激DAT的線粒體上特有的解偶聯(lián)蛋白-1提高表達(dá)。UCP-1對(duì)棕色脂肪的產(chǎn)熱功能主要通過提高線粒體電子轉(zhuǎn)運(yùn)率來大量產(chǎn)熱和消耗化學(xué)能[14]，最終降低體重和血糖。因此，番石榴葉提取物增強(qiáng)骨骼肌AMPK-PGC-1α-FNDC5信號(hào)通路傳導(dǎo)是其降低體重和血糖的途徑之一。