李世奎，范繼文，寧忠雄，路 偉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】新疆棉花種植面積占全國種植面積的74.3%，已成為國內(nèi)棉花供給的重要支柱[1-2]。隨著煙堿類殺蟲劑在新疆農(nóng)業(yè)的廣泛使用，吡蟲啉等傳統(tǒng)煙堿類殺蟲劑對環(huán)境中非靶標(biāo)生物尤其是傳粉昆蟲蜜蜂的安全性成為關(guān)注的焦點?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】劇曉青等[3]研究了吡蟲啉在茶葉的殘留分析方法及殘留動態(tài)，研究表明,吡蟲啉在鮮茶葉的半衰期分別是1.9～2.2 d。趙文晉等[4]采用高效液相色譜分析方法檢測了貴州開陽，黃平和桐梓3地吡蟲啉的殘留動態(tài)。結(jié)果表明,在稻田土壤中半衰期為2.79～3.03 d，在水稻植株中降解迅速，半衰期為1.73～2.14 d。仝東超等[5]通過田間試驗結(jié)果表明，按照1.5倍推薦劑量在小麥苗期手動噴施600 g/L吡蟲啉懸浮劑一次，吡蟲啉在土壤中殘留消解半衰期為6.6～10.0 d。Chauzat等[6]報道法國向日葵花粉的吡蟲啉平均為2～3 ng/g，是慢性中毒劑量的20～30倍，蜜蜂采集的花粉樣品中有69%樣品含有吡蟲啉及其代謝物。Godfray等[1]研究發(fā)現(xiàn)，花粉中的殘留量跨度很廣，在1.0～912 μg/kg。在南瓜花粉中吡蟲啉殘留是122 μg/kg，花蜜中是17.6 μg/kg。王成菊等[7]測定了1.7%阿維菌素/吡蟲啉微乳劑對蜜蜂的急性經(jīng)口和接觸毒性，經(jīng)口測得的LC50為1.790 mg/L，點滴法測得的LC50為0.039 mg/L。史曉斌等[8]試驗證實,吡蟲啉對蜜蜂也有很大傷害，亞致死劑量和慢性中毒就會影響蜜蜂的生理和行為?！颈狙芯壳腥朦c】2013年，歐盟限制吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪3種煙堿類殺蟲劑在禾谷類作物和蜜源作物上的使用[2]。2015年中國農(nóng)業(yè)部在全國范圍內(nèi)啟動實施了化肥農(nóng)藥使用量“零增長”行動。研究吡蟲啉在新疆棉花種植區(qū)的殘留與消解動態(tài)，評估其對傳粉昆蟲蜜蜂的安全性。【擬解決的關(guān)鍵問題】測定吡蟲啉在新疆棉田的殘留消解動態(tài)及對意大利蜂(Apismellifera)的急性接觸毒性，為吡蟲啉在新疆棉區(qū)使用時對傳粉昆蟲意大利蜂的安全風(fēng)險提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試生物

試驗蜜蜂蜂種為意大利蜂成年工蜂，試驗生物由沈陽市化工研究院于洪區(qū)王兵養(yǎng)殖場提供。意大利蜂于試驗前1 d收集，飼養(yǎng)于蜂籠內(nèi)，飼喂50%蔗糖水，放置在試驗環(huán)境中保持24 h適應(yīng)期，適應(yīng)期結(jié)束后剔除死亡或表現(xiàn)異常的個體，選擇大小一致健康的成年工蜂作為試驗測試的標(biāo)準(zhǔn)蜂。

1.1.2 儀器與試劑

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)UPLC-MS/MS(Waters Acquity I-Class系列超高效液相色譜系統(tǒng)、Waters Xevo TQ-S質(zhì)譜)。

95%吡蟲啉(imidacloprid)原藥(深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司)；70%吡蟲啉水分散粒劑(深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司)；乙腈(質(zhì)譜純，賽默飛世爾科技有限公司)，氯化鈉(分析純，天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)，無水硫酸鎂(分析純，天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)，C18粉末(北京青云有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 前處理方法

提取采用改進(jìn)的 QuEChERS 方法。棉花樣品，在均質(zhì)機(jī)中粉碎、勻漿，稱取10.00 g已經(jīng)勻漿的棉花葉片、花朵或土壤樣品至50 mL離心管，加入乙腈10.00 mL，渦旋30 s，超聲5 min，再加入無水硫酸鎂4.00 g和NaCl 1.00 g，渦旋提取30 s，在4 500 r/min速率下離心5 min。取上清液2 mL于凈化離心管(C18 50 mg、無水硫酸鎂150 mg)，然后渦旋30 s，在10 000 r/min速率下離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待UPLC-MS測定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC BEH C18column (Waters：(2.1×50) mm、1.7 μm)。在電噴霧離子化源(ESI)，多重反應(yīng)模式(MRM)進(jìn)行分析。流動相為水-甲酸(99.9∶0.1)和乙腈，梯度洗脫程序如下：0～3 min 水-甲酸∶乙腈=9∶1，3～7 min 水-甲酸∶乙腈=6∶4，7 min后水-甲酸∶乙腈=9∶1。流動相的流速為0.3 mL/min。正模式下質(zhì)譜條件：脫溶劑氣溫度和流速為500℃和800 L/Hr；毛細(xì)管電壓為3.5 kV。列出監(jiān)測離子參數(shù)。表1

表 1 多重反應(yīng)監(jiān)測條件(MRM)Table 1 The multiple response monitoring (MRM) condition for analytes detection

1.2.3 田間試驗

棉花和土壤的施藥和采樣方法參照 NY/T 788-2004《農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》進(jìn)行[9]。于2019年在昌吉華興農(nóng)場進(jìn)行田間試驗。設(shè)置空白對照區(qū)、消解動態(tài)處理區(qū)，每個小區(qū)100 m2，每個處理3次重復(fù)，小區(qū)及處理間設(shè)置保護(hù)行。70%吡蟲啉水分散粒劑對水后，于棉花開花期時以75 g a.i./hm2均勻噴灑在棉花上部，施藥1次。于施藥后0、1、3、6、12 h和1、3、5、7 d采樣。每個小區(qū)隨機(jī)3點采集棉花葉片、花樣品各20 g以及土壤樣品40 g。裝入自封袋，粘好標(biāo)簽，立即放于-20℃冰箱中保存，待測。

1.3 吡蟲啉對意大利蜜蜂急性接觸毒性

按照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則(報批稿)第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》[10]的要求進(jìn)行試驗，通過預(yù)試驗確定最高存活濃度和最低致死濃度。在預(yù)試驗濃度的基礎(chǔ)上，以一定的級差(級差小于2.2)設(shè)定4～6個濃度，用丙酮將藥劑配制成系列濃度，將度過適應(yīng)期的意大利蜂用二氧化碳麻醉約4 min，迅速用微量點滴器將藥液點滴在意大利蜂的中胸背板處，點滴量為2.0 μL/蜂，蜂身晾干后轉(zhuǎn)入試驗蜂籠內(nèi)，用50%蔗糖水飼喂。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)10只蜜蜂，并設(shè)置對照組。觀察24和48 h試驗用蜜蜂有無中毒癥狀及死亡現(xiàn)象，記錄死亡數(shù)，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，計算24和48 h LD50值及95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍及檢出限

準(zhǔn)確稱取吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1 000 mg/L母液，再用乙腈逐級稀釋為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別進(jìn)行線性回歸。在0.01～1.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，吡蟲啉的峰面積(y)與濃度(x)呈線性關(guān)系，回歸方程為y=4 010.25x+2 746.69，相關(guān)系數(shù)r為0.998 7，最低檢測濃度為0.02 mg/kg。表 2

2.2 準(zhǔn)確度及精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在棉花葉片和土壤空白樣品中，添加0.02、0.10 mg/kg 2個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)5次，測定添加回收率。在棉花葉片和土壤樣品的添加回收率介于94.27%～101.63%，相對偏差率介于2.01%～3.85%，符合農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則中對殘留檢測方法的要求，吡蟲啉峰型及響應(yīng)值均較好，能夠確保結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性 。表3，圖1

表 3 吡蟲啉在棉花葉片和土壤中的添加回收率Table 3 Recoveries of Imidacloprid in cotton leaf and soil samples at different levels

2.3 吡蟲啉在棉花葉片、花及土壤中的消解動態(tài)

研究表明，吡蟲啉在棉花葉中的消解速率相對于土壤中較快，其在棉花葉片中的消解半衰期4.02 d，在棉花花中的消解半衰期4.30 d，在土壤中的消解半衰期為5.27 d。消解過程均呈負(fù)指數(shù)函數(shù)變化，相關(guān)系數(shù)均R>0.7，符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程，吡蟲啉在棉花及土壤中的半衰期<30 d，屬于易降解農(nóng)藥。表4

圖 1 吡蟲啉的TIC圖
Fig.1 TIC spectrogram of Imidacloprid表4 吡蟲啉在棉花植株及土壤中的消解動態(tài)
Table 4 Degradation dynamics of Imidacloprid in cotton plants and soil

間隔期Interval殘留量Residualquantity(mg/kg)葉片花土壤0h0.7420.2960.3181h0.6550.2870.2983h0.6460.3440.2616h0.5220.5270.21512h0.2740.4190.3281d0.4060.1880.2423d0.2110.0420.0785d0.0460.0240.1777d

2.4 吡蟲啉對意大利蜜蜂急性接觸毒性

研究表明，意大利蜜蜂的死亡率與吡蟲啉呈現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系。吡蟲啉對意大利蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗的24 h LD50為0.072 7 μg a.i./bee；48 h LD50為0.064 9 μg a.i./bee。吡蟲啉毒性等級為高毒 。表5，表6

表6 農(nóng)藥對蜜蜂毒性等級劃分Table 6 Classification of pesticide toxicity to bees

3 討 論

吡蟲啉是煙堿類殺蟲劑的代表品種，具有良好的內(nèi)吸性，施用后會迅速被植物的根、莖、葉吸收并分布到整個植株，包括花和花粉。害蟲取食含有吡蟲啉的植物汁液而中毒死亡，非靶標(biāo)昆蟲也可以通過直接接觸和間接取食害蟲的方式接觸吡蟲啉。已有研究表明，在植物花粉中煙堿類殺蟲劑的檢出率極高，這與全球的蜜蜂消失癥候群有一定的相關(guān)性。Brandt[11]等發(fā)現(xiàn)87%的玉米花粉樣品能夠檢出吡蟲啉，檢出量大部分在10 μg/kg以下。Godfray等[2]研究發(fā)現(xiàn),吡蟲啉在花粉中的檢出率和殘留量都高于花蜜，若在植物拌種時使用吡蟲啉，則花粉中殘留量在1～51 ng/g；花蜜中為 1～8.6 ng/g；若用吡蟲啉處理土壤時，花粉中吡蟲啉含量約為9～66 ng/g，花蜜中吡蟲啉含量約為1～23 ng/g。吡蟲啉田間使用量約為100 mg/L，而吡蟲啉對蜜蜂的胃毒毒性為66.7 mg/L，說明蜜蜂在接觸到田間正常使用的吡蟲啉濃度時就會面臨死亡威脅。煙堿類殺蟲劑的使用會大大降低采集蜂的歸巢能力[12]，影響蜂群的衛(wèi)生行為[13]。Prisco等[14]的研究中發(fā)現(xiàn)噻蟲胺可以使蜜蜂體內(nèi)殘翅病毒(DWV)的爆發(fā)。

2013年12月，歐盟限制吡蟲啉，噻蟲胺，噻蟲嗪3種煙堿類殺蟲劑在禾谷類作物和蜜源作物上的使用[2]。而巴西、加拿大、美國等國家正在對3種新煙堿類殺蟲劑進(jìn)行常規(guī)性再登記評價，以期降低或避免其對蜜蜂種群的危害[15]。2018年9月1日，法國政府宣布禁止吡蟲啉、噻蟲胺、噻蟲嗪3種煙堿類殺蟲劑的使用。試驗測定了吡蟲啉在昌吉地區(qū)的殘留量及對蜜蜂的急性接觸毒性，從試驗結(jié)果可以看出，吡蟲啉對意大利蜜蜂的高毒。因此，應(yīng)高度關(guān)注其他傳統(tǒng)煙堿類殺蟲劑在新疆棉田使用時對傳粉昆蟲及其他天敵的安全性。

4 結(jié) 論

建立了吡蟲啉在棉花植株和土壤中的UPLC-MS殘留分析方法，前處理采用高效快速的QuEChERS方法，該方法重現(xiàn)性好，操作簡單，最低檢測濃度LOQ為0.02 mg/kg，滿足我國農(nóng)藥殘留分析試驗準(zhǔn)則的要求。雖然吡蟲啉在棉花葉片、花和土壤中的消解半衰期均小于7 d，但根據(jù)吡蟲啉對意大利蜂急性接觸毒性的實驗結(jié)果，吡蟲啉的毒性等級為高毒。在新疆棉區(qū)使用吡蟲啉或其他傳統(tǒng)煙堿類殺蟲劑時，應(yīng)加強(qiáng)關(guān)注該類殺蟲劑對傳粉昆蟲及其他天敵的安全性，提倡使用對傳粉昆蟲低毒的新一代煙堿類殺蟲劑作為替代產(chǎn)品在新疆棉區(qū)推廣使用。