楊梅花，黃祥，趙碩，舒暢，王遠(yuǎn)志*

(1 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

蜱(Tick)屬于寄螨目，后氣門亞目，蜱總科，包括硬蜱科、軟蜱科和納蜱科，世界已知蜱種超過900種[1-2]。我國記錄的硬蜱科有121種，軟蜱科10種，沒有納蜱[3]。不同蜱種的分布與氣候、地勢、土壤、植被和宿主等相關(guān)。

在傳播模式上，禽類、獸類均可成為蜱類的生物載體，鳥類的長距離遷徙和獸類的遠(yuǎn)距離活動，均可將蜱攜帶至遙遠(yuǎn)的地方，同時將蜱傳病原擴(kuò)散到新疫區(qū)[4-5]。

在硬蜱科分類下，以硬蜱屬包含的蜱種數(shù)量最多，國際現(xiàn)已報(bào)道的硬蜱種有244種[5]，我國報(bào)道的硬蜱種有24種，分別為漸尖硬蜱、銳跗硬蜱、嗜鳥硬蜱、伯氏硬蜱、草原硬蜱、粒形硬蜱、哈氏硬蜱、克什米爾硬蜱、哈薩克硬蜱、鼯鼠硬蜱、嗜麝硬蜱、寄麝硬蜱、鼢鼠硬蜱、日本硬蜱、擬蓖硬蜱、卵形硬蜱、全溝硬蜱、鈍跗硬蜱、西氏硬蜱、簡蝠硬蜱、中華硬蜱、基刺硬蜱、嗜貉硬蜱、長蝠硬蜱[6]。

在傳統(tǒng)的分類學(xué)中，硬蜱屬進(jìn)一步分為16個亞屬。基于形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和生態(tài)學(xué)特點(diǎn)，短須硬蜱亞屬是獨(dú)立的一個分支。短須硬蜱亞屬是硬蜱屬的第三大亞屬，全世界有40個蜱種屬于短須硬蜱亞屬成員[6]。在以往的研究中，我國報(bào)道有4個種，即：鼢鼠硬蜱、嗜鳥硬蜱、草原硬蜱、鈍跗硬蜱，而歐洲報(bào)道有原野硬蜱、凱瑟硬蜱、草原硬蜱、六角硬蜱、刺肩硬蜱等[7-8]。

長期以來，野生動物蜱種鑒定較為困難。主要原因主要包括：野生動物較為警覺，采樣十分困難；野生動物體表寄生蜱大多為飽血蜱，破壞了蜱的部分鑒定要點(diǎn)結(jié)構(gòu)，給蜱的形態(tài)學(xué)鑒定帶來極大挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)鑒定手段的提高，為蜱種鑒定帶來便利[9-10]。本研究對我國新出現(xiàn)的凱瑟硬蜱進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，在此作一介紹。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

自2016 年4 月至2017年8 月相繼從新疆伊犁哈薩克自治州和博爾塔拉蒙古自治州的亞洲獾(1只)和長尾黃鼠(31只)體表采集蜱種，對于蜱種保存于含有5%甘油的70%酒精用于形態(tài)學(xué)和分子鑒定。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

參照Walker主編的《寄生蜱鑒定指南》[11]和于心主編的《新疆蜱類志》[12]，用體視顯微鏡(LEICA M165 C)對采集的代表性硬蜱(亞洲獾體表蜱2只，長尾黃鼠體表硬蜱屬2只)進(jìn)行蜱種形態(tài)學(xué)鑒定，對蜱背面、腹面關(guān)鍵鑒定部位如盾板、氣門板、緣垛以及肛溝等對比觀察鑒定，并測量拍攝圖片。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

按DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說明書，分別提取8只代表蜱的基因組DNA置于-20 ℃?zhèn)溆?；依?jù)蜱種分子鑒定相關(guān)參考文獻(xiàn)[13-15]，針對線粒體16S rDNA、cytochrome oxidase I(cox1)基因序列，合成引物，實(shí)施PCR獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR產(chǎn)物送往北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行DNA序列測定，測定序列在GenBank中通過基本定位比對搜索工具(BLAST)進(jìn)行比對分析，并將序列上傳至美國國立生物技術(shù)信息中心。

1.4 遺傳進(jìn)化分析

用基因序列分析軟件MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(Maximum likelihood)分析亞洲獾和長尾黃鼠體表寄生蜱的親緣關(guān)系。在遺傳進(jìn)化分析過程中，選用自展檢驗(yàn)估計(jì)系統(tǒng)對遺傳進(jìn)化樹各個節(jié)點(diǎn)進(jìn)行置信值分析，繪圖重復(fù)參數(shù)設(shè)置為 1000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜱種采集和形態(tài)學(xué)鑒定

從亞洲獾體表共獲得21只硬蜱屬蜱，均為一種蜱；從長尾黃鼠體表共檢測到163只成蜱(127只革蜱屬成員，36只硬蜱屬成員)和103只若蜱。選取2只亞洲獾體表蜱和2只長尾黃鼠體表硬蜱屬成蜱進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察(圖1)。

兩種寄生宿主來源的硬蜱有如下共同特點(diǎn)：成蜱長約為2.3～2.7 mm，寬約1.5～1.7 mm；肛溝為前溝型，盾板無花斑，無眼，無緣垛，氣門板呈卵圓形，肛板和肛側(cè)板明顯，須肢和口下板細(xì)長，排列不緊密，足相對纖細(xì)，雄蜱表面被有大量細(xì)毛。

圖1 凱瑟硬蜱形態(tài)圖

2.2 蜱種分子鑒定

16SrDNA遺傳進(jìn)化樹分析表明4只代表蜱均為同一種蜱，其序列與歐洲凱瑟硬蜱聚為一簇，與六角硬蜱為近源種(圖2)；cox1基因遺傳進(jìn)化樹分析表明我國分布的凱瑟硬蜱較為古老(圖3)。并且發(fā)現(xiàn)來源于亞洲獾和長尾黃鼠凱瑟硬蜱在16SrDNA和cox1基因上不存在宿主差異性。

凱瑟硬蜱16SrDNA序列登錄號為MG763864、MG656445，cox1序列登錄號為MH279561和MH389246。

圖2 基于16S rDNA基因?qū)Υ眚邕M(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析

圖3 基于cox1基因?qū)P瑟硬蜱進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析

3 討論

短須硬蜱亞屬成員常寄生于犬科、鼬科和猬科等穴居哺乳動物或鳥類。在以往研究中，凱瑟硬蜱的寄生宿主有沙狐、紅狐和獵狗。本研究首次從亞洲獾和長尾黃鼠體表發(fā)現(xiàn)了凱瑟硬蜱，該研究成果擴(kuò)大了凱瑟硬蜱寄生宿主的國際認(rèn)識范圍。

基于線粒體16SrDNA測序和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)：相對于原野硬蜱、簡蝠硬蜱、嗜鳥硬蜱、紫色硬蜱等短須硬蜱亞屬成員，凱瑟硬蜱和六角硬蜱具有較近的親緣關(guān)系，在遺傳進(jìn)化樹上單獨(dú)形成一支；基于線粒體cox1基因遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，歐洲來源的凱瑟硬蜱共有13個單倍型，分別為L、M、N、O、P、Q、R、S、T單倍型，M和T單倍型僅存在于德國，而來自羅馬尼亞、塞爾維亞、匈牙利的凱瑟硬蜱單倍型在不同采集地點(diǎn)和宿主來源在各國表現(xiàn)不一[6]。在本研究中，16SrDNA遺傳進(jìn)化樹分析表明4只代表蜱均為同一種蜱，其序列與歐洲凱瑟硬蜱聚為一簇，與六角硬蜱為近源種；cox1基因遺傳進(jìn)化樹分析表明我國分布的凱瑟硬蜱較為古老，并且發(fā)現(xiàn)來源于亞洲獾和長尾黃鼠凱瑟硬蜱在16SrDNA和cox1基因上不存在宿主差異性。

新疆地理生態(tài)景觀多樣，蜱種類別也存在多樣性的特點(diǎn)[16]。我國共計(jì)有24種硬蜱屬成員，伯氏硬蜱、哈薩克硬蜱、哈氏硬蜱、雷氏硬蜱、擬蓖硬蜱、全溝硬蜱、嗜鳥硬蜱7種硬蜱屬成員曾報(bào)道在新疆存在[3]。在本研究中，首次在中國發(fā)現(xiàn)了凱瑟硬蜱，該成果擴(kuò)大了我國蜱種的種類范圍。未來須加強(qiáng)凱瑟硬蜱攜帶病原的深入研究，進(jìn)一步為我國蜱傳疾病的防控提供科學(xué)依據(jù)。