高同國 袁紅莉 侯慧云 姚艷輝 高 峰

1 河北農業(yè)大學生命科學學院 保定 071000

2 中國農業(yè)大學生物學院 北京 100193

氮元素是控制初級生產力的關鍵元素之一，氮循環(huán)是構成地球生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)的核心組成部分，主要包括生物體內有機氮的合成、氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用（圖1）[1]。微生物在各種形態(tài)氮的轉化過程中發(fā)揮著重要作用，是驅動氮循環(huán)的強大引擎[2，3]。雖然氮肥的使用在很大程度上提高了作物產量，但我國氮肥利用率不足30%，施入土壤的氮肥大部分通過氨揮發(fā)、硝化-反硝化、淋洗、徑流等途徑損失，造成氮肥資源嚴重浪費[4]，且導致自然界原有的氮循環(huán)嚴重失衡，引起水體富營養(yǎng)化、土壤酸化、溫室氣體排放等一系列環(huán)境問題，氮平衡問題受到全球廣泛關注。

圖1 氮循環(huán)示意圖[1]Fig.1 Schematic of the nitrogen cycle

腐植酸是由芳香族及其活性官能團構成的天然高分子酸性有機混合物，外觀呈黑色或褐色，在土壤、濕地和煤炭中均有分布。自然界中的腐植酸是由動植物殘骸經微生物的分解和轉化及長期的地球化學作用形成和積累的。腐植酸在農業(yè)生產中具有改良土壤性質、刺激作物生長、增加養(yǎng)分吸收利用、提高作物抗逆和改善農產品品質等功效。此外，腐植酸是土壤的重要組成部分，與土壤酶活性和土壤微生物活動密切相關。并且腐植酸在地球氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用，不僅可以絡合吸附無機氮化合物，參與含氮化合物轉化，還可以影響與氮循環(huán)相關酶的活性以減緩氮肥釋放速度，提高氮肥利用率，減少化肥施用量，調節(jié)氮循環(huán)相關微生物的活動，影響氮循環(huán)相關微生物數(shù)量等。本文總結了腐植酸在氮循環(huán)各個環(huán)節(jié)中的作用，以期為更廣泛和深入地研究腐植酸物質提供理論基礎，為腐植酸調控和管理氮平衡提供參考。

1 腐植酸含有氮元素

腐植酸的分子量、化學成分、結構、官能團，及其聚電解質性質因地域、形成年代、提取方法不同而差異較大[5～7]。根據(jù)腐植酸對酸、堿溶解度的差異，腐植酸分為黃腐酸、棕腐酸、黑腐酸。元素分析結果表明，自然界中提取得到的腐植酸主要由碳、氫、氧、氮、磷、硫等元素組成，其中氮的含量因原料來源、提取方法等差別很大，一般在0.5%～7.3%之間[8～10]。并且熱處理會增加提取的腐植酸中氮元素的含量[11]。腐植酸含有氮元素，是氮循環(huán)的組成部分之一，腐植酸中的氮可以礦化為無機氮，供給植物吸收利用。

2 腐植酸絡合吸附無機氮

腐植酸是一種結構復雜的大分子聚合物，分子量從幾百到三十萬道爾頓之間。腐植酸以芳香族核為結構主體，附以各種官能團，有羧基、羰基、醌基、酚羥基、醇羥基、氨基、酰胺基、甲氧基等[12]，使其具有很好的絡合和螯合能力，可通過絡合、螯合、吸附等作用與其他物質形成穩(wěn)定的復合物。腐植酸還可以與土壤中氨以共價鍵形式結合。Nommik等[13]研究土壤有機質的固氨現(xiàn)象，推測氨通過共價鍵與腐殖物質上的某些官能團結合，生成一種抵抗微生物硝化、反硝化轉化過程，又防止進一步化學變化的酸不能水解的物質，這部分氨不會被礦化，可以被植物利用。Burge等[14]的研究結果表明，腐植酸結合氨的現(xiàn)象與腐植酸中羥基有關，與醛基無關。

腐植酸具有較高的陽離子交換能力和較強的吸附能力，在調控土壤氮素有效性，保蓄NH4+以及降低氨揮發(fā)量等方面起著重要作用[15]。腐植酸的羧基及酚羥基等能與尿素反應，形成腐植酸-脲絡合物，在此反應中，羧基起更重要的作用。尿素在反應中分解出部分氨態(tài)氮能被羧基固定，減少氮素損失。腐植酸添加量會影響到腐植酸尿素中的官能團數(shù)量及水溶性腐植酸含量，進而影響尿素的緩釋效果[16，17]。尿素施入土壤后水解為銨態(tài)氮再經硝化作用轉變?yōu)橄鯌B(tài)氮，腐植酸增加了對土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的吸附，從而減少了土壤氮素的淋溶，增加了土壤氮素殘留量，有效地降低氮肥向深層土壤的遷移，從而更好地滿足作物根系需肥特性[18]。研究表明，腐植酸與氨的吸附與環(huán)境中pH關系密切，在pH為4～8時，隨著pH的升高，腐植酸對NH4+的吸附和解吸過程更易進行，特別是在弱堿條件下，腐植酸對NH4+的吸附和解吸附效果更好[19]。

3 腐植酸參與無機氮轉化

空氣中存在少量的二氧化氮氣體，Stemmler等[20]首次發(fā)現(xiàn)在有腐植酸存在時，空氣中含有的二氧化氮在光照條件下可以轉化成亞硝酸，這一過程在黑暗條件下不能發(fā)生。推測認為腐植酸在光照條件下生成了一種還原劑，促使二氧化氮轉變成亞硝酸。并且這一過程在隨后報道中得到證實[21，22]，研究發(fā)現(xiàn)這一過程與光的照射強度，含有的腐植酸濃度、環(huán)境相對濕度、厭氧環(huán)境等有關[23]。這一發(fā)現(xiàn)說明腐植酸能夠在一定條件下改變氮素的存在形式。

早在1992年，腐植酸參與氮化合物轉化的過程被證實。Thorn等[24]用同位素15N標記氫氧化銨，采用15N、13C NMR技術研究了銨的轉化形態(tài)，表明大部分的氮進入腐植酸中轉化成了吲哚和吡咯形式的氮，接著轉變成嘧啶、吡嗪、氨基化合物和氨基醌。Dong等[25]的研究也證實了腐植酸參與氮化物的轉化過程，表明腐植酸可結合尿素或硫酸銨，在化學反應中生成中間及終產物態(tài)氮，并以Nδ/Nε-精氨酸、Nω/Nα-瓜氨酸、氨基酸或氨基糖中游離或離子化的氨基以及NH4+形式存在于腐植酸中。氮肥（NO3-）大量使用過程中，NO3-經過微生物反硝化或化學作用，生成NO2-和溫室氣體N2O等，從而造成了水質和氣候的改變，破壞生態(tài)平衡。腐植酸可以與生成的NO2-反應，從而抑制反硝化過程，提高氮肥利用率，減少環(huán)境污染[26]。腐植酸的這一過程與其含有的羧基相關，并且通過pH改變腐植酸中羧基和酚基的含量來影響質子的轉移和氣態(tài)亞硝酸（HONO）與NO2-的平衡，即pH越小HONO產率越高[27]。這種化學抑制反硝化的條件發(fā)生在中性或微酸性的土壤環(huán)境中，Thorn等[24]用Na15NO2、15NH2OH和15NH3分別標記泥炭腐植酸，培養(yǎng)后經固相CP/MAS15N NMR檢測，得到了化學位移在169 nm和31 nm處的新峰，對應氮的形態(tài)分別是雜環(huán)氮，游離氨基酸和氨基糖，說明亞硝酸可以與腐植酸發(fā)生化學反應，減少亞硝酸的積累量。莊振東等[18]利用同位素示蹤技術的結果也證實施用腐植酸氮肥明顯地抑制了土壤中氮素的硝化作用從而也抑制了土壤的反硝化作用。

4 腐植酸促進有機氮礦化

有機氮礦化是指有機態(tài)氮經微生物分解形成無機態(tài)氮的過程。植物吸收的一部分氮來自于土壤有機物礦化氮。腐植酸在氮礦化中具有重要的促進作用，但同時土壤的腐殖化程度直接影響氮礦化速率[28]。氮礦化一般通過測定土壤中總氮及總碳的含量來預測礦化氮的比率，莊振東等[29]發(fā)現(xiàn)施用腐植酸氮肥可增加土壤氮肥盈余量和土壤氮素礦化量，腐植酸氮肥能較好地調節(jié)土壤C/N比，提高土壤氮肥礦化作用。芳香化程度低的腐植酸更有利于有機氮的礦化，Ve等[30]將芳香化程度低的礦物源腐植酸和芳香化程度高的腐植酸鈣加入到不同水稻土壤中厭氧培養(yǎng)6周，結果發(fā)現(xiàn)：隨著腐植酸芳香化程度的增加，礦化氮的量成指數(shù)遞減，說明水稻土壤礦化氮的比率受土壤有機物芳香化程度影響，即有機質芳香化程度越高，礦化氮的比率越低，反之亦然。隨后Olk等[31]也證實青年腐植酸中存在的大量木質素酚化合物結構不利于氮礦化的進行。但腐植酸的腐殖化程度如何影響到氮礦化的，這一機理尚不清楚。

5 腐植酸促進植物對氮的吸收與分布

Pamela等[32]在其相關綜述中指出，眾多研究都表明，腐植酸能促進植物對氮素的吸收。腐植酸影響氮的同化，并影響到硝酸還原酶活性等植物氮代謝相關酶的活性[33]，促進氮的吸收和代謝，增加可溶性蛋白質含量，促進氨基酸合成，對硝酸鹽代謝產生積極影響。此外，植物中與氮同化、三羧酸循環(huán)相關酶活性和轉錄也受到顯著刺激[34]。Ertani等[35]也證實了腐植酸可以改變植物中硝酸鹽代謝和蛋白質合成相關酶的活性。腐植酸可以使玉米根和葉中硝酸鹽含量下降，蛋白質含量增加，而總氮含量則保持穩(wěn)定；腐植酸可以使谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性有較高的增加，硝酸還原酶活性基本不受影響。另外，腐植酸還可以增加有機氮合成和光合作用相關酶活性[36]，以滿足植物對氮的需求。總之，腐植酸可以影響植物氮代謝相關酶的活性。

但作物對土壤中氮素的吸收能力還受腐植酸添加量及土壤氮素水平的影響。土壤中添加一定量的腐植酸可以提高氮肥的有效性，但并不是越多越好，過多反而會產生不利影響[37]。Tahir等[38]的研究表明，土壤中腐植酸施用量為60 mg/kg土的中等用量，對小麥生長和氮素吸收具有較好的促進作用，而在較高的添加量90 mg/kg土時反而不利于小麥的生長及氮素的吸收，這可能由于腐植酸中含的羧基、酚羥基、羰基、醌基等多種官能基團與尿素、銨離子等發(fā)生絡合反應，官能團的多少直接影響到尿素的使用效果[12]。其次，腐植酸是否能夠促進氮素的吸收也取決于環(huán)境中氮素水平。腐植酸對黃瓜幼苗NO3-的吸收，表現(xiàn)為低氮脅迫下促進吸收、高氮脅迫下抑制吸收的趨勢。腐植酸顯著降低了低氮、高氮脅迫下根系和葉片中的銨態(tài)氮含量，不同程度地提高了氮脅迫下根系和葉片的硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、谷氨酸脫氫酶活性及根系中亞硝酸還原酶活性，還提高了根系和葉片中游離氨基酸、可溶性蛋白的含量[38]。

6 腐植酸穩(wěn)定脲酶活性

農業(yè)生產中使用最多的氮肥形式為尿素，其需要經脲酶轉化成植物能夠直接利用的氮素形式——氨，即脲酶可以將尿素分解成氨和二氧化碳，因此脲酶在氮素循環(huán)中具有重要作用。腐植酸不僅可以抑制脲酶的活性，也可以提高脲酶的穩(wěn)定性[16]。游離脲酶隨著時間的延長穩(wěn)定性逐漸下降，而脲酶-腐植酸復合物對脲酶有一定穩(wěn)定作用，特別是在堿性條件下，腐植酸能夠有效地提高溶液中脲酶的穩(wěn)定性，并且隨著腐植酸與脲酶比例的增加，復合物中脲酶的活性逐漸增加[39]。腐植酸可以增加脲酶熱穩(wěn)定性中的抗熱性，防止蛋白酶對其分解[40]。腐植酸和脲酶的相互作用主要取決于復合物的相互作用基團和靜電吸引力，但是在等電點處氫離子的作用和補償離子的釋放在兩者結合中也起著重要作用[39]。高分子量的腐植酸能穩(wěn)定脲酶的活性，而低分子量的腐植酸反而抑制酶的活性，說明不同分子量和結構的腐植酸對酶的作用不同[41]。Dong等[42]的研究結果表明，在使用尿素時添加腐植酸可以在短時間內對脲酶起抑制作用，大分子量的腐植酸在較長時間內能夠穩(wěn)定脲酶的活性，從而在一定時間內穩(wěn)定尿素轉變成氨的速率，持久有效地供給植物可直接吸收利用的氨。相反，若尿素短時間內大量轉化成氨，不但不能夠全部被植物吸收而造成氮肥利用率降低，而且一部分氨將轉化成硝酸鹽進而通過反硝化作用最終對環(huán)境造成污染。即腐植酸可以穩(wěn)定脲酶的活性，提高尿素的利用率。

7 腐植酸提高生物固氮能力

生物固氮是土壤中氮素的重要來源之一，是生物圈氮循環(huán)中重要的途徑。生物固氮分為自生固氮、聯(lián)合固氮和共生固氮，其中以共生固氮能力效率最高。Allison等[43]首先發(fā)現(xiàn)腐植酸可以增加藍綠藻的生長及固氮作用，Bhardwaj等[44]發(fā)現(xiàn)腐植酸能夠促進聯(lián)合固氮菌Azotobacter chroococcum的生長及固氮能力，并推測認為這種固氮能力的提高與腐植酸中含有的活性離子或與腐植酸促進的細胞數(shù)量增加有關。隨后多篇文獻報道了腐植酸可以促進豆科植物結瘤固氮過程。腐植酸可以增加大豆、花生等豆科植物的根瘤干重[45]，提高田菁等豆科植物[46，47]的結瘤數(shù)量、根瘤重量以及固氮酶活性，并且提高豇豆根瘤中氮含量[48]。袁紅莉等[49]也證實了微生物降解褐煤生成的水溶性腐植酸可以增加豆科植物的結瘤量，增加根瘤重量；同時可提高單位質量苜蓿中根瘤固氮酶活性，進一步增加苜蓿的固氮總量，2年使苜蓿增產高達25.02%[50]。此外，上述水溶性腐植酸還能夠提高大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium liaoningense CCBAU05525的細胞密度；腐植酸中含有的黃酮類似物的結構可促進根瘤菌結瘤基因及固氮相關基因的表達，從而使大豆的結瘤數(shù)、根瘤鮮重、固氮酶活性分別提高19.4%～30.5%、25.4%～36%、15%～30%[51]。腐植酸可以增強生物固氮能力，但其機理尚不清楚。

8 腐植酸改變氮循環(huán)相關微生物數(shù)量

腐植酸會影響土壤中與氮循環(huán)相關微生物的活性。如陳靜等[52]發(fā)現(xiàn)腐植酸能夠加劇土壤微生物活動，尤其能使土壤自生固氮菌的數(shù)量顯著增加，生物固氮作用得到加強，為作物提供豐富的氮素營養(yǎng)。并且實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)（QPCR）結果表明，腐植酸可以增加參與氮循環(huán)微生物的豐度[53]，即腐植酸可以通過調節(jié)根際參與氮循環(huán)微生物的豐度、基因表達及代謝活動，從而實現(xiàn)植物對氮素營養(yǎng)的利用。此外，腐植酸可以通過抑制土壤脲酶活性來影響氨的釋放速度，從而影響氨氧化微生物的群落結構，抑制因尿素加入導致的氨氧化細菌和氨氧化古菌數(shù)量增加，降低氨氧化菌與植物競爭氨，減少氨的損失，提高尿素利用率；同時阻止部分氨轉化為硝酸，降低了對環(huán)境的污染[16，54]。Kraiem等[55]采用熒光原位雜交技術（FISH）發(fā)現(xiàn)，受腐植酸濃度影響，厭氧反應器中厭氧氨氧化細菌及其共生菌的豐度顯著降低，異養(yǎng)反硝化細菌明顯生長。另外，雖然高通量測序技術已成功用于土壤微生物群落結構的分析，也有較多的研究表明，腐植酸可以提高細菌的數(shù)量和豐度，但未發(fā)現(xiàn)該技術用于腐植酸對氮循環(huán)相關微生物研究的報道。

9 總結和展望

土壤是地球上最大的碳庫，腐植酸是土壤中的重要組成部分，腐植酸在土壤中的穩(wěn)碳固碳功能及在地球碳循環(huán)中的作用得到人們的認可。但腐植酸在氮循環(huán)中的作用目前多集中于氮肥的利用上。腐植酸與氮循環(huán)之間的關系主要體現(xiàn)在絡合無機氮起到緩釋效果、參與無機氮化物的轉化途徑、抑制硝化與反硝化作用提高氮肥利用率、提高氮肥的礦化作用、促進植物吸收氮素、提高豆科植物結瘤固氮能力、提高土壤脲酶等土壤酶活性、影響氮循環(huán)相關微生物的數(shù)量等。本文首次總結了腐植酸在氮循環(huán)中的作用，以期為合理開發(fā)利用腐植酸相關產品，研究腐植酸相關產品在氮循環(huán)中的作用機理，管理土壤中的氮素平衡提供理論基礎。

腐植酸在氮循環(huán)中的部分作用已經證實，但大多集中于腐植酸如何提高氮肥利用率上。隨著腐植酸研究的深入以及應用范圍的逐漸擴大，腐植酸與氮循環(huán)之間的關系將逐漸清晰，目前還需要完成以下幾方面的工作。

（1）腐植酸結構與活性之間的關系。

國內外對腐植酸進行了多年的研究，但腐植酸產品因其地域、來源、提取方法差異等因素，結構復雜多樣，化學組成及官能團結構差異明顯，勢必造成其功能與使用上的差異。關于腐植酸結構的研究方法很多，多集中于采用核磁共振、紅外光譜、元素分析等方法對腐植酸的元素組成、分子量、芳香化程度、氧化程度等信息進行表征，揭示其與活性之間的關系。即使采用現(xiàn)代檢測手段與先進的設備，腐植酸與活性之間的關系目前仍不太清楚，依然是今后研究的重點與難點。

（2）腐植酸與氮循環(huán)相關微生物的關系。

自然界中氮循環(huán)均由微生物驅動，微生物在各種形態(tài)氮的轉化過程中發(fā)揮著重要作用。目前關于腐植酸與氮循環(huán)相關微生物的研究很少，多集中于硝化細菌和反硝化細菌研究上，固氮微生物的研究也有，但還比較少，機理也尚不清楚。今后研究腐植酸驅動氮循環(huán)相關微生物的活動對揭示腐植酸在地球氮循環(huán)中的作用和地位十分重要，又可為利用腐植酸管理土壤氮素水平提供理論依據(jù)。

（3）腐植酸提高豆科植物結瘤固氮能力的作用機理。

生物固氮在全球氮循環(huán)和農業(yè)生產中占有十分重要的地位，根瘤菌-豆科植物共生固氮體系是生物固氮中最強的固氮體系，每年固氮量占生物固氮總量的65%。根瘤菌與豆科植物形成的共生結構——根瘤是氮固定場所。利用根瘤菌劑接種豆科植物提高固氮效率在國外應用廣泛，如美國、巴西等國。增加豆科植物種植面積和接種根瘤菌可以減少化肥施用量。氮肥的過量施用導致土壤氮殘留量較高，進而抑制根瘤菌對豆科植物的侵染，減少豆科植物根瘤數(shù)量。腐植酸可以提高豆科植物結瘤數(shù)量及固氮酶活性，但其機理尚不清楚。研究腐植酸促進生物固氮的機理在減少化肥施用、保護生態(tài)環(huán)境、提高農作物產量、維持農業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面具有重要作用。