張召興，李佩國，陳 玥，李蘊玉，張香齋，賈青輝，張建文

（1. 河北科技師范學院 河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北 秦皇島 066004；2. 河北旅游職業(yè)學院 畜牧獸醫(yī)系，河北 承德 067000）

雞大腸桿菌病是雞養(yǎng)殖中的常見病和高發(fā)病之一，在臨床中呈現病型多樣，其中以急性敗血癥型為常見，具有發(fā)病快，死亡率的特點[1-2]。發(fā)病雞和帶菌雞是雞大腸桿菌病的主要傳染源，該病不僅可以通過經呼吸道、消化道傳播，還可以經卵傳播，可以感染不同日齡的雞，以雛雞和青年雞易感性較高，且季節(jié)性不明顯，常與其它疾病混合感染，給養(yǎng)雞業(yè)造成很大的危害[3-4]。雞大腸桿菌擁有復雜的抗原結構和多樣性血清型，主要包括O 抗原、表面K 抗原及鞭毛H 抗原3種菌體抗原，其中O 抗原是臨床中大腸桿菌主要血清型鑒定的抗原[5]。相關研究表明大腸桿菌O 抗原血清型共有196 種，我國報道中雞大腸桿菌的主要流行的血清型有O1、O2、O5、O7、O78、O103等，雞大腸桿菌血清型眾多，且不同血清型之間的菌株缺乏交叉免疫，不同地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型不同，無法通過疫苗的免疫獲得保護性，給疫苗的研制帶來一定的困難[6-7]?？咕幬锸钱斍胺乐卧摬〉闹匾侄沃?，由于長期、不合理的應用，致使大腸桿菌耐藥性日益嚴重，耐藥機理改變，呈現多重耐藥和交叉耐藥。另外，大腸桿菌在宿主體內被殺死后所釋放的內毒素可引起多種疾病，同時也造成藥物殘留威脅人們的健康，成為公共衛(wèi)生問題[8]。

2018 年～2019 年，本研究團隊采集秦皇島、唐山、承德、邢臺等地區(qū)不同養(yǎng)殖場病死蛋雞的肝臟、心血、脾臟等病料組織173 份，從中分離得到120 株大腸桿菌，對其進行血清型、耐藥性及耐藥基因研究，并分析其流行病學特點，為河北地區(qū)蛋雞大腸桿菌防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及主要試劑 肝臟、心血、脾臟等病料組織173 份，采集自2018 年～2019 年秦皇島、唐山、承德、邢臺等地區(qū)不同養(yǎng)殖場病死蛋雞，E.coli 質控菌株ATCC25922 由河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室保存。

麥康凱培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯均購自青島高科園海博生物技術有限公司；24 種抗菌藥物購自上海宸功生物技術有限公司；ExTaq DNA 聚合酶均購自TaKaRa 公司；DL2000 Marker 購自北京中科瑞泰生物科技公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；E.coli 標準O 型血清因子、0.5%石炭酸生理鹽水均購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 細菌分離純化與鑒定 采集的病死雞的肝臟、心血、脾臟等病料組織按常規(guī)方法處理后，接種于麥康凱培養(yǎng)基37 ℃恒溫劃線培養(yǎng)12 h～18 h，挑取單個菌落接種于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，37 ℃、12 h～18 h 進行鑒定培養(yǎng)，同時進行革蘭氏染色鏡檢與生化鑒定。

1.3 細菌16S rRNA PCR 鑒定 利用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA，參照文獻[5]合成大腸桿菌16S rRNA 基因保守區(qū)引物，采用PCR 方法進行分離菌株鑒定，引物合成及PCR 產物測序均在上海生工生物工程有限公司進行。測序結果采用NCBI-BLAST 比對，鑒定標準按照同源性≥97%判定。

1.4 細菌O 型血清型鑒定 參考文獻[7]，采用E.coli 標準O 型血清因子，采用玻片凝集試驗檢測分離菌株的O 型血清型，以0.5%石炭酸生理鹽水作為對照。

1.5 細菌的耐藥性檢測 采用K-B 藥敏紙片法對分離菌株進行藥敏試驗，以大腸桿菌ATCC 25922作為質控菌株，參照美國臨床檢驗標準委員會（NCCLS）推薦的藥敏試驗操作方法和標準進行試驗結果判斷[9]，對分離菌株的試驗結果進行統計，分析其耐藥性。

1.6 細菌耐藥基因的PCR檢測 參考文獻[10-11]，由上海生工生物工程有限公司合成43種大腸桿菌耐藥基因引物，包括：β-內酰胺類（blaTEM、blaSHV、OXA-1、ACT-1、blaCTX-5），氨基糖苷類（aadA1、aadA2、StrA、StrB、aaC2、aaC4、aadB、aadD、npmA、ant-Ia、aac（3）-Ia、aac（6）- Ib），四環(huán)素類（tetA、tetB、 tetC、 tetD、 tetE、 tetG、 tetM）， 酰 胺 醇 類（floR），大環(huán)內酯類（ermA、ermB、mefA），磺胺類（dhps、Sul-1、Sul-3），喹諾酮類（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA、oqxB、gyrA、gyrB、gyrC、gyrE）。利用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA，以提取的基因組DNA 為模板，采用PCR 方法進行檢測，將PCR 產物送上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果采用NCBIBLAST 比對，鑒定標準按照同源性≥97%判定。

1.7 細菌的耐藥表型與耐藥基因相關性分析 參考文獻，采用統計學軟件SPSS19.0 分析河北地區(qū)分離的120 株大腸桿菌耐藥表型及耐藥基因型之間相關性，計算其符合率。

2 結 果

2.1 細菌的分離鑒定結果 通過麥康凱培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基及營養(yǎng)肉湯對分離菌菌株進行分離與純化及染色鏡檢、生化鑒定、16S rRNA 鑒定。結果顯示，從采集的173 份病料組織中分離到了120 株大腸桿菌，分離率為69.4%，其中秦皇島分離45 株、唐山21 株、形臺28 株、承德26 株。表明大腸桿菌在河北地區(qū)蛋雞養(yǎng)殖中廣泛流行。

2.2 細菌O 型血清型鑒定結果 采用E.coli 標準O型血清因子，利用玻板凝集試驗檢測分離菌株的O型血清型。結果顯示，分離的120 株大腸桿菌分離菌株分屬于6 種血清型，其中O78 型90 株，占分離菌株的74.2%；O2 型14 株，占分離菌株的11.7%；O89 型11 株，占分離菌株的9.2%；O1 型3 株，占分離菌株的2.5%；O18 型2 株，占分離菌株的1.7%；O38 型1 株，占分離菌株的0.8%。表明該地區(qū)分離的120 株大腸桿菌以O78 型、O2 型和O89 型為主要的流行血清型。

2.3 細菌耐藥性分析結果 采用K-B 藥敏法對河北地區(qū)分離的120 株大腸桿菌進行了藥敏試驗，分析其耐藥性及多重耐藥性。結果顯示：分離的120株大腸桿菌對復方新諾明、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、頭孢拉啶、林可霉素、新霉素、土霉素、青霉素8 種藥物耐藥較高，耐藥率75.8%～98.3%；對多西環(huán)素、卡那霉素、氨芐西林、頭孢曲松、恩諾沙星、環(huán)丙沙星6 種藥物耐藥率45.8%～71.7%；對其它藥物的耐藥率15.0%～43.3%（表1）。

表1 大腸桿菌分離株耐藥性檢測結果Table 1 Antibiotic resistance rate of all isolated E.coli

按區(qū)域對耐藥性進行分析，結果顯示秦皇島、唐山、邢臺、承德4 個地區(qū)分離的大腸桿菌對青霉素、阿莫西林、 林可霉素、磺胺間甲氧嘧啶、復方新諾明、磺胺二甲氧嘧啶6 種藥物耐藥性嚴重，其中秦皇島分離的大腸桿菌對頭孢曲松、頭孢拉定、多西環(huán)素、氟苯尼考、新霉素5 種藥物耐藥嚴重，唐山分離的大腸桿菌對頭孢拉定、慶大霉素、大觀霉素、新霉素、土霉素、多西環(huán)素、替米考星7 種藥物耐藥嚴重，邢臺分離的大腸桿菌對氨芐西林、頭孢拉定、卡那霉素、慶大霉素、大觀霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星9 種藥物耐藥性嚴重，承德分離的大腸桿菌對氨芐西林、頭孢拉定、卡那霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星6 種藥物耐藥嚴重（表2）。表明河北地區(qū)分離的120株大腸桿菌耐藥性比較嚴重，秦皇島、唐山、邢臺、承德4 個地區(qū)的耐藥性呈現多樣性。

多重耐藥性分析結果顯示，由分離的120 株大腸桿菌分離菌株中，耐3、4、7 種藥物的菌株各1株（0.83%），耐6種藥物的菌株3株（2.50%），耐8種藥物菌株4株（3.33%），耐9、10、12、14藥物的菌株各7株（5.83%），耐11 種藥物的菌株13 株（10.83%），耐13、15 種藥物的菌株各9 株（7.50%），耐16、17 種藥物的菌株各11 株（9.17%），耐18 種藥物的菌株8 株（6.67%），耐19、20、21、22 種藥物的菌株各5 株（4.17%），其中1 株菌最高耐23 種藥物。表明河北地區(qū)分離的120 株大腸桿菌對臨床中常用的24 種抗生素呈現多重耐藥現象。

表2 不同地區(qū)對各抗生素耐藥的大腸桿菌菌株數Table 2 Number of resistant E.coli isolates from different areas

2.4 細菌耐藥基因檢測結果 采用PCR 方法對河北地區(qū)分離的120 株大腸桿菌分離進行43 種耐藥基因檢測。結果顯示，分離菌株攜帶29 種耐藥基因，檢測出率為67.4%（29/43）， 耐藥基因ant-Ia、tetC、tetB、tetA、aadA1、blaTEM、OXA-1、tetM 檢測出率最高，檢出率84.2%～99.0%；耐藥基因gyrB、floR、gyrC、gyrE、blaCTX-5 的檢出率78.3%～66.7%；耐藥基 因gyrA、 dhps、 aaC2、 StrA 的 檢 出 率55.8%～42.0%；耐藥基因aadB、aaC4、oqxB、aadA2、sul-3、aac（6）-Ib、oqxA、ermB、strB、sul-1、tetD、aac（3）-Ia12 的檢出率38.3%～19.2%；其余14 種耐藥基因未檢出。表明河北地區(qū)分離的120 株大腸桿菌攜帶多種耐藥基因。

多重耐藥基因型分析結果顯示，分離的120 株大腸桿菌分離菌株中，攜帶10 種耐藥基因的菌株1株（0.83%），攜帶11、12、20、22 種耐藥基因的菌株各3 株（2.50%），攜帶13 種耐藥基因的菌株11 株（9.2%），攜帶14、15 種耐藥基因的菌株各12 株（10.0%），攜帶16 種耐藥基因的菌株19 株（15.8%），攜帶17 種耐藥基因的菌株18 株（15.0%）；攜帶18 種耐藥基因的菌株22 株（18.3%），攜帶19 種耐藥基因的菌株7 株（5.8%），攜帶21 種耐藥基因的菌株6 株（5.0%）（圖1）。表明河北地區(qū)分離的120 株大腸桿菌攜帶多重耐藥基因，呈現多重耐藥基因型。

2.5 細菌的耐藥表型和耐藥基因型相關性分析結果 經過統計學軟件分析河北地區(qū)分離的120 株大腸桿菌耐藥表型及耐藥基因型之間相關性。結果顯示，β-內酰胺酶類、酰胺醇類四環(huán)素類3 類抗菌藥物的耐藥表型和耐藥基因型符合率均為100%，磺胺類、喹諾酮類大環(huán)內酯類、氨基糖苷類的耐藥表型和耐藥基因型符合率72.7%～93.8%（表3）。表明河北地區(qū)分離的120 株大腸桿菌耐藥表型及耐藥基因型之間基本呈正相關。

圖1 大腸桿菌分離菌株多重耐藥基因型檢測結果Fig.1 Detection of multi-drug resistance genotypes of E.coli isolates

表3 大腸桿菌分離菌株耐藥表型和耐藥基因型相關性分析結果Table 3 Relevance analysis of drug resistance phenotype and genotype of E.coli isolates

3 討 論

目前，雞大腸桿菌可以通過垂直傳播，種雞有可能成為該病主要傳染源之一，在蛋雞養(yǎng)殖業(yè)中需加強防治。本實驗從河北地區(qū)病死蛋雞病料組織中分離鑒定出120 株大腸桿菌，其中以O78 型、O2 型和O89 型為該地區(qū)主要流行的優(yōu)勢血清型，可以做為研制雞大腸桿菌多價疫苗的候選株。賈雪波等報道2016 年上半年分離自安徽和山東部分地區(qū)的80株APEC 以12.5%菌株（10 株）O1 血清型，15.0%菌株（12 株）為O2 血清型，25.0%菌株（20 株）為O78 血清型，47.5%菌株（38 株）為其它未定血清型[12]。徐政平報道江蘇、山東、浙江、上海、安徽等5省市不同地區(qū)的分離得到120 株雞源大腸桿菌流行的優(yōu)勢血清型為O78 和O88[4]。刁有江等報道山東部分地區(qū)的45家養(yǎng)禽場分離到致病性大腸桿菌96 株中以O78、O2、O15、O18、O143、O88 等6 種優(yōu)勢血清型[13]。本研究結果與上述報道的存在一定差異性，說明地區(qū)間大腸桿菌血清型呈現多樣性分布流行。結合本課題組2017 年從河北秦皇島地區(qū)不同養(yǎng)殖場的中分離到46 株蛋雞源致病性大腸桿菌，研究發(fā)現以O78、O89、O142 及O1 為優(yōu)勢血清型[5]，可以得出近幾年蛋雞源O89 型大腸桿菌作為優(yōu)勢血清型在在河北地區(qū)流行，國內在別的地區(qū)報道較少，應該引起重視。臨床中雞大腸桿菌常與支原體等病原混合感染，是蛋雞養(yǎng)殖生產常見傳染病，造成相關疾病的免疫失敗，進而導致新城疫、禽流感等病毒性疾病的爆發(fā)[2-4]。因此，防治雞大腸桿菌病是降低雞其它傳染病發(fā)病率的重要基礎。

雞大腸桿菌耐藥性產生與平時飼養(yǎng)管理具有密切的關系，在養(yǎng)殖過程中，長期不合理的使用抗菌要藥物，小劑量使用等，均導致大腸桿菌的很強的耐藥性[14]。相關研究表明養(yǎng)殖業(yè)中常用的阿莫西林、氨芐青霉素、復方新諾明、鏈霉素、四環(huán)素等抗生素，出現普遍的耐藥性，其耐藥率甚至達到了100%，并且出現了大量多重耐藥菌株，甚至可能演化出“超級細菌”，另外還可以通過糞便傳播耐藥性大腸桿菌[15]。由于抗菌藥物的不合理的使用，雞大腸桿菌產生超廣譜-內酰胺酶（ESBLs），攜帶ESBLs的質粒，不僅耐β-內酰胺類抗生素的菌株同時也對氟喹諾酮類、氨基糖苷類有一定的多重耐藥性，使產ESBLs 菌具有多重耐藥表型[16]。大腸桿菌耐性的產生與飼養(yǎng)管理有很大相關性，其耐藥性遺傳學的“誘發(fā)突變”是由藥物導致的可遺傳的變化，由于外界的條件改變可導致耐性的“適應性變異”[17]。同時耐藥性質粒可以在不同菌株之間通過一定的方式在傳播，進而導致多重耐藥性菌株產生[18]。本實驗分離的120 株大腸桿菌耐藥性嚴重，且呈現多重耐藥性。與本實驗室賈青輝等報道的2013 年～2016 年河北地區(qū)分離鑒定的104 株蛋雞源大腸桿菌的耐藥性及多重耐藥表型相比，具有一定的升高趨勢[19]?？赡苡捎诖竽c桿菌長期接觸某種抗菌藥物可以產生的選擇性壓力，進而導致其耐藥性的產生。經統計秦皇島、唐山、邢臺、承德4 個地區(qū)分離的大腸桿菌對24 種抗菌藥物呈現多樣性耐藥性，針對該病防治應該根據藥敏試驗，合理使用抗菌藥物，減少耐藥性產生，提高治療，對臨床中蛋雞大腸桿菌病防治具有重要指導意義。蛋雞養(yǎng)殖場中可以通過控制環(huán)境、消毒等預防大腸桿菌病的發(fā)生與流行，使用益生菌、中藥等制劑防治大腸桿菌病，減少或者替代抗菌藥物的使用。

大腸桿菌基因組中編碼的耐藥基因主要位于質粒和轉座子等可移動基因元件上，在外界抗菌藥物對細菌產生選擇壓力時，可以改變大腸桿菌的耐藥機制，進而細菌對抗菌藥物耐產生很強的藥性，且可以在不同菌株中擴散與傳播，大腸桿菌攜帶耐藥基因型的表達在耐藥性中起著重要的作用[19-20]。許多研究表明，耐藥基因與耐藥具有一定相關性。本實驗通過檢測分析表明，耐藥表型與耐藥基因型攜帶基本呈正相關。與于靜晨等[10]報道的從江蘇、安徽等地分離的53 株禽致病性大腸桿菌耐藥基因與耐藥菌株檢出率基本呈正相關一致。耐藥表型與攜帶的耐藥基因型符合率不一致，有可能還存在其它耐藥基因，或者有其它耐藥機制產生的耐藥性。因此，大腸桿菌耐藥基因型的表達致使耐藥性的產生及在不同菌株傳播機理尚未明確，有待進一步研究。本研究結果提示在蛋雞養(yǎng)殖過程中應該注意抗菌藥物合理使用，同時本研究為河北地區(qū)蛋雞大腸桿菌的防控提供了參考。