陳怡文 張臘紅 洪理泉 陳菊萍 唐磊明 陳兆軍

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所致，是以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。世界衛(wèi)生組織對(duì)于結(jié)核病最新報(bào)道顯示目前全球約有1/3人感染過MTB，2015年全球新發(fā)病例1 040多萬，約140萬人死于結(jié)核病，我國(guó)結(jié)核患者數(shù)量居全球第三位[1]。目前傳統(tǒng)的結(jié)核檢測(cè)方法如標(biāo)本直接涂片抗酸染色鏡檢、分離培養(yǎng)鑒定等均無法滿足快速診斷的要求，采用BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)涂片陽性痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)也需要7～10d才能完成[2]，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不能滿足臨床快速診斷結(jié)核病及其防治的需求。分子檢測(cè)手段能夠提高臨床肺結(jié)核的診斷率。臨床目前常用GeneXpert MTB是全自動(dòng)一體化熒光定量PCR儀專用的MTB檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)靈敏度和特異度高于現(xiàn)有檢測(cè)方法[3]，也是目前WHO推薦使用的分子檢測(cè)方法。近年來，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SAT）作為新一代核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，其靈敏度遠(yuǎn)高于其它核酸檢測(cè)技術(shù)，已廣泛用于病原體檢測(cè)領(lǐng)域[4-5]，特別在涂片陰性痰液標(biāo)本中有較高的陽性率，可以降低肺結(jié)核臨床誤診率。本研究采用SAT、GeneXpert MTB和快速液體培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)肺結(jié)核和其他呼吸系統(tǒng)疾病患者的同一份痰液樣本進(jìn)行MTB檢測(cè)，比較3種方法學(xué)的差異，評(píng)估SAT在肺結(jié)核快速診斷中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 選取2016年1月至10月在杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié)核科就診的可疑初治肺結(jié)核患者108例，男76例，女32例，年齡35～65歲，平均44歲。并選取同期呼吸科非肺結(jié)核呼吸道疾病患者15例作為對(duì)照組，男10例，女5例，年齡24～65歲，平均44歲。最終108例可疑肺結(jié)核患者中，確診為肺結(jié)核患者102例，非MTB感染者6例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2010年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的“結(jié)核診斷與治療指南”[7]。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 BACTECTMMGITTM960 System全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)BD公司），GeneXpert擴(kuò)增檢測(cè)儀（美國(guó)Cepheid公司），分枝桿菌超聲破碎儀、恒溫混勻儀（上海仁度生物科技有限公司），ABI7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司），抗酸染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），SAT試劑盒（上海仁度生物科技有限公司），GeneXpert MTB檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Cepheid公司）。

1.3 標(biāo)本采集及前處理 采集患者清晨痰液，參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》的方法[6]，于采集2h內(nèi)將痰液標(biāo)本直接進(jìn)行抗酸染色鏡檢，再進(jìn)行前處理后分別進(jìn)行SAT、GeneXpert MTB和快速液體培養(yǎng)。前處理過程：挑取約5ml痰液，加入2倍的2%NALC-NaOH前處理液，強(qiáng)力漩渦振蕩20s；室溫靜置15～20min；加入無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8） 至約 50ml，蓋緊蓋子；3 000g 離心15min，棄上清液；添加 1～3ml PBS（pH 6.8），混勻備用。

1.4 痰直接抗酸染色鏡檢 挑取標(biāo)本有干酪樣、膿樣或可疑部分涂片，抗酸染色后鏡檢報(bào)告結(jié)果。

1.5 SAT檢測(cè) 將前處理后的痰液進(jìn)行如下操作：（1）RNA提取：取前處理后的痰液1ml于樣品處理管中，13 000g離心5min，棄上清液，加入50μl TB稀釋液，充分振蕩混勻，即制成待測(cè)樣本；將待測(cè)樣本和50μl制備好的陽性及陰性對(duì)照放入分枝桿菌破碎儀內(nèi)，功率為300W的超聲處理15min后，13 000g離心5min，上清液即為提取的RNA。（2）擴(kuò)增：將2μl RNA提取物加入30μl擴(kuò)增檢測(cè)液的微量反應(yīng)管中，置于恒溫混勻儀上60℃ 10min，42℃ 5min后向反應(yīng)管中加入10μl已 42℃預(yù)熱的酶液，立即蓋上管蓋振蕩15s混勻。（3）檢測(cè)：將微量反應(yīng)管快速置于ABI 7500熒光定量PCR儀內(nèi)，程序設(shè)置（選取FAM通道；42℃ 1min，40個(gè)循環(huán)；每分鐘采1次熒光，共40次；反應(yīng)體系42μl），立即運(yùn)行擴(kuò)增程序。（4）結(jié)果判斷：樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)（Ct）≤35的樣本為陽性，35＜Ct＜40需復(fù)查，結(jié)果Ct＜40為陽性，Ct為40或無數(shù)值為陰性。

1.6 BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng) 取前處理好的痰標(biāo)本0.5ml接種至MGIT培養(yǎng)管中，放入BACTECTMMGITTM960 system進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)陽性標(biāo)本送至杭州疾病控制中心進(jìn)行菌種鑒定。

1.7 GeneXpert MTB檢測(cè) 取處理好痰液1ml加入收集管中，加入相當(dāng)于2倍痰液體積的處理液，旋緊管口，渦旋震蕩15～30s，室溫培養(yǎng)15min。打開檢測(cè)盒，取2ml處理后的樣本由加樣孔緩慢加入檢測(cè)盒內(nèi)，然后將檢測(cè)盒放置到檢測(cè)模塊，儀器開始自動(dòng)檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下直接觀察結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。以臨床診斷為對(duì)照，分別計(jì)算SAT、GeneXpert MTB法和BACTECTMMGITTM960 System檢測(cè)MTB的陽性率、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，不同檢測(cè)方法結(jié)果的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

108例疑似肺結(jié)核患者痰樣本經(jīng)檢測(cè)，SAT、GeneXpert MTB法和快速液體培養(yǎng)檢測(cè)MTB的陽性率分別為 62.0%（67/108）、64.8%（70/108）和 50.0%（54/108）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，快速液體培養(yǎng)法的陽性率分別與SAT和GeneXpert MTB 法比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.4、7.5，均 P＜0.05）；SAT 法的陽性率與 GeneXpert MTB 法比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.2，P ＞0.05）。

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，SAT、GeneXpert MTB法和快速液體培養(yǎng)對(duì)MTB檢測(cè)的靈敏度分別為65.7%（67/102）、68.6%（70/102）和 47.1%（48/102）；特異度分別為 100%（21/21）、100%（21/21）和 71.4%（15/21）；陽性預(yù)測(cè)值分別為 100%（67/67）、100%（70/70）和 88.9%（48/54）；陰性預(yù)測(cè)值分別為 37.5%（21/56）、39.6%（21/53）和 21.7%（15/69）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，快速液體培養(yǎng)法的靈敏度分別與SAT和GeneXpert MTB法比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.0、18.38，均 P＜0.05）；SAT 法的靈敏度與 GeneXpert MTB 法比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.2，P＞ 0.05）。

涂片陽性樣本中，SAT、GeneXpert MTB法和快速液體培養(yǎng)的靈敏度分別為 89.1%（49/55）、89.1%（49/55）和83.6%（46/55），3者靈敏度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。涂片陰性標(biāo)本中SAT、GeneXpert MTB法和快速液體培養(yǎng)的靈敏度分別為 38.3%（19/47）、44.7%（21/47）和 4.3%（2/47），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，快速液體培養(yǎng)法的靈敏度分別與SAT和GeneXpert MTB法比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.3、21.8，均 P＜0.05）；SAT 法的靈敏度與 GeneXpert MTB 法比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.39，P ＞0.05）。見表1。

3 討論

MTB的感染已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。傳統(tǒng)的MTB檢測(cè)方法是抗酸染色及金標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng)加鑒定[8-9]，然而這些方法靈敏度低且需要菌量大，檢測(cè)周期長(zhǎng)，這可能使得結(jié)核病患者無法快速診斷而錯(cuò)過最佳治療時(shí)間，如何快速檢測(cè)出MTB，以供臨床早期診斷，一直是結(jié)核病研究的重要課題。

目前GeneXpert MTB作為WHO推薦使用的分子檢測(cè)MTB的方法在臨床開始使用，其是基于檢測(cè)靶核酸為DNA的全自動(dòng)一體化熒光定量PCR，能在2h內(nèi)從患者新鮮痰液中直接檢出是否含有MTB，檢測(cè)靈敏度和特異度均很高。但目前在中國(guó)GeneXpert MTB檢測(cè)結(jié)核及其利福平耐藥的費(fèi)用較高，且臨床收費(fèi)暫未進(jìn)入患者醫(yī)保，因此難于廣泛應(yīng)用于臨床。

本研究選取了同樣具有高靈敏度和特異度的SAT法對(duì)疑似肺結(jié)核患者痰液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示SAT和GeneXpert MTB法對(duì)疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本檢測(cè)的陽性率、靈敏度和特異度均明顯高于BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng)法，結(jié)果與Cui等[10]研究得出的SAT靈敏度和特異度均優(yōu)于BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng)法的結(jié)論相符。SAT與GeneXpert MTB法在涂陰的樣本中的檢出率也明顯高于BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng)法，降低了臨床對(duì)肺結(jié)核的誤診率。

表1 SAT、GeneXpert和MGIT 960在臨床診斷中的方法學(xué)比較

SAT法的原理是通過特異性的MTB核糖體RNA擴(kuò)增引物及優(yōu)化探針技術(shù)，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及極高轉(zhuǎn)錄活性的T7 RNA多聚酶同時(shí)實(shí)現(xiàn)核酸恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。此技術(shù)檢測(cè)周期明顯縮短，僅需4h即可完成檢測(cè)，并且能特異性檢測(cè)MTB，相比BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間進(jìn)一步縮短，且彌補(bǔ)了培養(yǎng)法無法鑒別結(jié)核與非MTB的缺陷。本實(shí)驗(yàn)樣本中臨床診斷為非MTB感染者的痰液有6例，均為BACTECTMMGITTM960培養(yǎng)法檢測(cè)陽性，而SAT檢測(cè)為陰性，進(jìn)一步證實(shí)了SAT法能特異性檢測(cè)MTB。應(yīng)用于臨床可以提示醫(yī)生對(duì)于痰培養(yǎng)陽性而SAT法為陰性結(jié)果的患者是否可能考慮為非MTB感染[11]。

另外SAT與GeneXpert MTB相比，GeneXpert MTB檢測(cè)核酸類型為DNA，由于操作不當(dāng)易引發(fā)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)交叉污染，且無法區(qū)別活菌與死菌[12-13]。而SAT檢測(cè)核酸類型為RNA，只在活菌中存在，在環(huán)境中極易降解，可作為活動(dòng)性結(jié)核診斷及藥物療效監(jiān)測(cè)的方法，并且能減少實(shí)驗(yàn)室污染和假陽性率[14]。當(dāng)然SAT法也有一定的缺點(diǎn)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中確診為肺結(jié)核患者的樣本中有4例涂陽培陽樣本經(jīng)SAT檢測(cè)結(jié)果為陰性，可能的原因是此樣本中存在RNA酶抑制劑、MTB量少或者檢測(cè)懸液分布不均等原因[14]。但是SAT法總體假陰性率比較BACTECTMMGITTM960液體培養(yǎng)法已經(jīng)明顯減低。

綜上所述，SAT與世界衛(wèi)生組織推薦使用的分子診斷技術(shù)GeneXpert MTB同樣都擁有較高的靈敏度、特異度和陽性率，甚至有優(yōu)于它的特點(diǎn)；應(yīng)用SAT技術(shù)僅需4h即可檢測(cè)MTB活菌，提高了臨床上肺結(jié)核快速診斷的準(zhǔn)確率及靈敏度，對(duì)肺結(jié)核快速診斷有重要的價(jià)值，值得進(jìn)一步臨床推廣和應(yīng)用。