曾玉群 邵麗娜 何強 戴振華

器官移植手術后的排斥反應是困擾器官移植發(fā)展的主要難題之一。免疫抑制劑的使用是器官移植界的重大突破，然而長期服用免疫抑制劑會導致多種毒副反應，例如導致感染、誘發(fā)腫瘤等[1]。因此，探索移植排斥的免疫機制，尋找新的藥物作用靶點是抑制移植排斥和誘導移植物長期存活或免疫耐受的重要策略。

近幾十年我國器官移植飛速發(fā)展，針對抗移植排斥的藥物研究，祖國醫(yī)學在動物與臨床試驗中取得了較大進展。多項研究顯示中醫(yī)藥在抗移植免疫排斥以及減少免疫抑制劑不良反應方面具有良好的療效[2]。目前中醫(yī)理論認為器官移植后排斥反應會使機體處于氣虛、血瘀、痰濕互結狀態(tài)，相關中藥被證明能抑制動物器官移植排斥反應，尤其是多個活血化瘀中藥的抗排斥作用[3]。但中藥成分復雜，靶點眾多，機制不明，影響了進一步開發(fā)及其臨床使用。

網(wǎng)絡藥理學是2007年英國藥理學家Hopkins提出的概念，其基于系統(tǒng)生物學將藥物分子、作用靶點及疾病3者的網(wǎng)絡關系相連，從而研究藥物治療疾病的作用機制[4]。網(wǎng)絡藥理學為我國中醫(yī)藥的研發(fā)提供了新思路和新策略。本研究將利用網(wǎng)絡藥理學去挖掘活血化瘀中藥作用于同種異體移植排斥的活性成分及其機制，為中醫(yī)藥抗器官移植排斥提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 活血化瘀中藥來源于《中藥學》課本第十二章活血化瘀藥[5]，共包括川芎、延胡索、郁金、姜黃、乳香、沒藥、丹參、紅花、桃仁、益母草、澤蘭、牛膝、雞血藤、王不留行、月季花、凌霄花、鳳仙花、土鱉蟲、自然銅、蘇木、骨碎補、血竭、兒茶、劉寄奴、莪術、三棱、水蛭、虻蟲、斑蝥、穿山甲32味中藥。中藥活性成分來自BATMAN-TCM在線數(shù)據(jù)庫[6]，同種異體移植排斥靶基因來自 PALM-IST[7]及 GeneCards數(shù)據(jù)庫[8]。

1.2 中藥活性化合物及靶標的篩選 采用BATMANTCM在線數(shù)據(jù)庫[6]（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索獲取中藥活性成分及相關靶基因。BATMAN-TCM在線數(shù)據(jù)庫是第一個專門為中藥分子機制設計的在線生物信息學分析工具，目前被中醫(yī)藥領域廣泛使用，其基于藥物與藥物、蛋白與蛋白相似性算法來預測每一種中藥及方劑的潛在靶點。檢索參數(shù)選擇中藥各化合物成分得分（Score Cut off）≥48 分，P≤0.05。

1.3 關鍵活性成分靶基因集的構建 利用PALM-IST[7]（http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm）及GeneCards[8]（https://www.genecards.org/）在線數(shù)據(jù)庫，以“同種異體移植排斥（allograft rejection）”作為檢索關鍵詞，獲取相關靶基因作為疾病病理靶標。同時與中藥活性成分所預測的靶基因進行匹配，采用Cytoscape 3.3.0軟件[9]構建活血化瘀中藥關鍵活性化合物的靶基因集。最后使用STRING數(shù)據(jù)庫[10]（http://string-db.org/），選擇“homo sapiens（人類）”物種進行靶基因間相互作用分析。PALM-IST數(shù)據(jù)庫是基于Pubmed的文獻資源進行基因/蛋白名稱、藥物、疾病等生物實體及其相互關系提取的檢索工具，其可根據(jù)文獻的摘要進行數(shù)據(jù)檢索挖掘。GeneCards數(shù)據(jù)庫是目前使用最多的人類基因靶點集成數(shù)據(jù)庫，其自動集成了150多個網(wǎng)絡來源的基因數(shù)據(jù)，包括了基因組學、蛋白質(zhì)組學、轉錄組學以及疾病等信息，其界面友好，方便用戶使用。STRING數(shù)據(jù)庫是目前使用最廣泛的進行已知和預測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互之間作用關系的數(shù)據(jù)庫。

1.4 靶基因基因本體（gene ontology，GO）和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析利用DAVID[11]（https://david.ncifcrf.gov/）及STRING數(shù)據(jù)庫將獲取的所有關鍵活性成分靶標進行生物信息學在線分析，包括GO分析和通路分析：對靶標基因進行GO注釋，并計算每條GO項目的P值，以P＜0.05為標準篩選出顯著性富集的GO項目，獲得GO相關生物學過程、分子功能、細胞成分等；對靶標進行KEGG通路注釋，得到其所參與的通路及每條通路的P值，以P＜0.05為標準篩選出顯著性通路，最終得到與同種異體移植排斥的相關通路。DAVID數(shù)據(jù)庫是目前使用最廣泛的可對大量基因背后的生物學含義進行全面功能注釋的在線工具。

1.5 中藥-活性成分-靶標-移植排斥的網(wǎng)絡構建及分析 對活血化瘀中藥活性成分與同種異體移植排斥靶標之間的復雜關系進行網(wǎng)絡分析。利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息，將得到的活血化瘀中藥關鍵化學活性成分、關鍵活性成分的靶標、重要的同種異體移植排斥靶標及相互作用的蛋白連接在一起，以構建中藥-活性成分-靶標-移植排斥網(wǎng)絡。使用Cytoscape 3.3.0對網(wǎng)絡進行可視化和分析，并使用Cytoscape軟件的NetworkAnalyzer APP計算每個節(jié)點的拓撲特征。將具有較高“連接度（degree）”、“介數(shù)（betweenness centrality）”的網(wǎng)絡節(jié)點識別為同種異體移植排斥的候選活血化瘀中藥的核心靶標[9]。

2 結果

2.1 活血化瘀中藥活性成分的篩選 32味活血化瘀中藥經(jīng)BATMAN-TCM檢索后總共獲得922個相關活性化合物，得到503個獨立的具有化學結構的化學活性成分，其中最主要的9種活性成分具體見表1，可知活血化瘀類中藥具有一些共同的化學活性成分，且姜黃、郁金、川芎3種中藥是活血化瘀中藥含有主要活性成分的代表中藥。

表1 活血化瘀中藥主要含有的活性成分

2.2 活血化瘀中藥關鍵活性成分靶標的篩選 經(jīng)BATMAN-TCM檢索后共獲取相關化學活性成分預測的相關靶標5 224個，獨立靶標共554個。經(jīng)PALM-IST工具檢索到與同種異體移植排斥相關的靶基因共2 397個（共10 960篇摘要），經(jīng)GeneCards檢索到相關的靶基因共1 679個，將得到的靶標去掉重復基因最后得到同種異體移植排斥靶基因共704個。經(jīng)Cytoscape 3.3.0軟件將704個同種異體移植排斥靶基因與554個活血化瘀中藥活性成分靶基因匹配后共篩選出67個關鍵靶基因，選擇較高的連接度中位數(shù)的3倍（連接度≥12）和介數(shù)獲得關鍵17個靶基因，見表2。進一步使用STRING工具獲取17個關鍵靶標之間的相互作用關系（選擇最低互相關系得分0.4），共獲取44個互相關系，見圖1。

2.3 生物GO富集及通路分析 經(jīng)DAVID工具對17個預測關鍵靶基因進行GO富集后，共獲得52條生物學含義富集結果，其中包括生物學過程41項，分子功能8項，細胞成分3項，主要的GO生物學過程富集結果見表3，可見多條相關生物學過程均與免疫反應、炎癥反應、細胞凋亡等過程相關。進一步進行KEGG的通路分析，得到主要的16條通路見圖2，可見核因子κB（NF-κB）信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路和過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號通路主要參與活血化瘀中藥活性成分作用于同種異體移植排斥的相關藥理機制。

2.4 中藥-活性成分-靶標-移植排斥網(wǎng)絡分析 根據(jù)篩選出來的活血化瘀中藥關鍵26種活性成分的17個核心靶標及其網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，利用Cytoscape 3.3.0軟件構建中藥-活性成分-靶標-同種異體移植排斥網(wǎng)絡圖（圖3）。進一步利用藥理網(wǎng)絡分析關鍵活血化瘀活性成分作用于同種異體移植排斥的相關藥理機制可能是活血化瘀中藥的活性成分主要是萜類化合物包括如莪術二酮（Curdione）、香芹酮（Carvone）、丹參新酮（Miltirone）、百里酚（Thymol）、姜黃酮（Turmerone）等通過 NF-κB 信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路以及PPAR信號通路作用于 PTGS2、LTA、ATM、TNF、APOA2、PPARG、IL-13、IL-1B靶標從而改善同種異體移植排斥反應，見圖4。

表2 關鍵活性成分17個核心靶基因

圖1 關鍵17個靶基因間相互作用關系

表3 關鍵靶基因主要生物學過程

圖2 關鍵靶標的潛在信號通路

圖3 核心中藥-活性成分-靶標-移植排斥網(wǎng)絡藥理圖（關鍵17個靶標）

圖4 活血化瘀中藥活性成分作用于同種異體移植排斥的藥理機制

3 討論

眾所周知，免疫排斥反應是限制同種異體器官移植的主要原因，細胞免疫是免疫排斥反應的主要啟動機制。細胞免疫中T淋巴細胞在移植免疫排斥中起著關鍵作用。T細胞中的輔助性T（T help，Th）細胞包含不同的亞群[12-13]，主導細胞免疫，主要分泌IL、干擾素（Interferon，IFN）等細胞因子，其中Th1主要分泌IFN-γ等，Th2主要分泌 IL-4、IL-5等，Th17主要分泌 IL-17A、IL-22以及IL-13等[14]。Th1細胞是參與移植免疫應答的主要免疫細胞，而Th2細胞對移植排斥反應有一定的調(diào)節(jié)作用，Th17細胞可能在一定程度上也參與了移植排斥反應，IL-17在移植排斥中大量分泌也促使移植排斥反應[15-16]。因此靶向IL-17可抑制同種異體移植排斥反應。而由抗體介導的體液免疫也參與移植排斥反應，其中包括慢性排斥系統(tǒng)炎癥反應，例如NF-κB通路也參與其中等[17-18]。另外，目前的相關研究顯示TNF受體及相關分子可控制淋巴器官的發(fā)育，影響T細胞和抗原遞呈細胞的活化和存活，并改變細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[19]。且越來越多的數(shù)據(jù)表明腫瘤壞死因子受體（TNFR）/TNF超家族成員對移植免疫中發(fā)揮作用的CD8+T細胞的功能尤為重要，可見其在移植排斥中具有重要作用[20]。因此靶向TNFR/TNF超家族分子的策略似乎很有可能用于控制或預防移植器官和組織的排斥反應?？梢姳狙芯客诰虻腎L-17、TNF以及NF-κB信號通路及相關靶標如IL-13、IL-1B、TNF等與移植排斥機制緊密相關，作用于其信號通路及靶標將成為抗同種異體移植排斥藥物開發(fā)的重要策略。

我國臨床器官移植已開展五十余年，中醫(yī)藥及其活性化合物被用于抗器官移植排斥及減少免疫抑制劑的毒副反應，且取得一定的療效。常用的中藥如雷公藤中分離出來的雷公藤多甙包括萜類化合物雷公藤甲素以及冬蟲夏草中提取的FTY-720均證明可有效抑制臨床患者移植排斥反應，可協(xié)同免疫抑制劑發(fā)揮抑制器官移植排斥且同時降低免疫抑制劑的毒副反應，已成為新的免疫抑制劑[21-23]。另外多個主要活血化瘀中藥活性成分也都在抗器官移植排斥中發(fā)揮作用，如蘇木提取物蘇木素A可延長大鼠心臟移植物的存活，從而減弱大鼠心臟同種異體移植的急性排斥反應[24]；川芎嗪可聯(lián)合小劑量環(huán)孢素（cyclosporine，CsA）抑制小腸移植急性排斥反應更佳[25]；姜黃素具有免疫抑制作用，在BN-WKY模型大鼠中單用姜黃素14d可將其平均生存時間由9.1d延長至20.5～24.5d，聯(lián)合姜黃素和CsA可延長至28.5～35.6d，比單用CsA效果好[26]；筆者也證實了相關活血化瘀中藥活性成分山奈酚（Kaempferol）可通過提高叉頭狀螺旋轉錄因子3表達而增加調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）數(shù)量以協(xié)助小劑量CsA更好發(fā)揮免疫抑制作用，從而最大限度降低CsA的不良反應[27]；Lu等[28]也發(fā)現(xiàn)丹參素（Tanshinol）可顯著延遲小鼠同種異體移植心臟排斥反應，并與雷帕霉素（Rapamycin）發(fā)揮協(xié)同作用延長小鼠同種異體心臟移植物的存活時間。因此，本研究挖掘出了作用于同種異體排斥反應的主要活血化瘀中藥包括川芎、丹參、姜黃、莪術、郁金等，且預測了其可能發(fā)揮作用的主要活性化合物，這將有助于進一步挖掘出對器官移植排斥有效的免疫抑制新藥，以及可改善免疫抑制劑毒副反應的輔助新藥。

為了揭示對疾病和涉及藥物的活性物質(zhì)的相關作用，本研究進行了網(wǎng)絡藥理學分析，以研究活血化瘀中藥作用于同種異體移植排斥的相關藥理機制。通過網(wǎng)絡藥理學方法，筆者從分子或系統(tǒng)水平構建活性化合物與蛋白質(zhì)/基因靶標之間相互作用的生物網(wǎng)絡，預測了與同種異體移植排斥相關的活血化瘀中藥活性成分和潛在靶標。預測結果表明活血化瘀中藥26種活性成分與17個與同種異體移植排斥相關的靶標相互作用。結果提示一些活性成分可以同時調(diào)節(jié)相同的靶標，這很好地解釋了中藥的協(xié)同機制。值得一提的是，計算模型只能給出提示與預測，仍然需要通過實驗進行驗證。對中藥藥理機制的理解是其現(xiàn)代化的必要條件，網(wǎng)絡藥理學的綜合和整體思想與中藥整體觀的本質(zhì)是一致的。因此，網(wǎng)絡藥理學可以被認為是預測和發(fā)現(xiàn)治療特定疾病的新藥研發(fā)的有效方法，這將為揭示中醫(yī)藥的作用機制提供新的策略。