楊春鳳 張媛媛 林向華 林帝金 王璐 生秀杰 張建平

1中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州510120）；2廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州510150）；3中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院婦科（北京100000）；4河南省人民醫(yī)院生殖中心（鄭州450003）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion， RSA）是一種較難處理的、關(guān)乎女性生殖、心理健康的疾病，影響了1%～2%的夫婦［1］。其有一半的原因不詳，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［2］。胚胎被認為是半同種異體，母體免疫系統(tǒng)能對來源于50%父方遺傳物質(zhì)的胚胎發(fā)生同種免疫識別，并通過復(fù)雜的免疫調(diào)控，建立起一個對胎兒局部免疫耐受但又不被外來物所攻擊的微環(huán)境。一旦這種免疫平衡失控，將容易引發(fā)流產(chǎn)或產(chǎn)科并發(fā)癥［3］。目前這種母胎之間的免疫耐受機制成為近年國內(nèi)外對URSA 生殖免疫研究的熱點［4］，但仍不完善，有必要進一步研究尋找新的機理。

調(diào)節(jié)性B 細胞（regulatory B cells，Breg）是20 世紀60年代發(fā)現(xiàn)的一群具有免疫抑制功能的B 淋巴細胞［5］，直到2002年才被首次正式命名的［6］，在自身免疫性疾病、腫瘤免疫、器官移植免疫、感染和變態(tài)反應(yīng)這些領(lǐng)域有重要的免疫負向調(diào)控作用［7-10］。在生殖免疫方面，近年國外學者發(fā)現(xiàn)正常妊娠小鼠脾臟的Breg 細胞比例高于非孕小鼠和自然流產(chǎn)小鼠［11］，同樣在人體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn)用正常妊娠女性外周血清培養(yǎng)的CD19+CD24hiCD27+Breg細胞擴增比例顯著高于非孕期和自然流產(chǎn)［12］。國內(nèi)僅陳現(xiàn)等學者研究表明合并抗磷脂綜合征的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg 細胞明顯低于無抗磷脂綜合征的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者和對照組。Breg 細胞在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)母胎耐受機制中的作用尚不清楚。因此，本研究調(diào)查正常健康育齡女性和URSA 患者在非孕期和早孕期外周血Breg 細胞水平的情況，探討其臨床意義，為進一步研究復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病機制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 選擇研究對象及分組選取在中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的RSA 患者86 例，平均年齡（30.22 ± 2.97）歲，其中31 例在非孕期，55 例在早孕期，平均孕周（6.40 ± 1.64）周。同期體檢中心正常健康育齡女性58 例，平均年齡（27.36 ±4.37）歲，其中30 例在非孕期，29 例在早孕期，平均孕周（7.41 ± 2.20）周。RSA 患者滿足2 次及2 次以上復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷，同時排除既往已知病因的流產(chǎn)。正常健康育齡女性排除既往存在不良孕產(chǎn)史者。所有對象均排除自身免疫性疾病、移植器官、腫瘤、嚴重感染、多囊卵巢綜合癥、垂體泌乳素瘤、糖尿病、高血壓、動靜脈血栓、冠心病等合并癥。每位研究對象均予知情同意，并通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審批（［2014］倫備第（49）號）。

1.2 標本采集檢查對象需要生活飲食處于日常狀態(tài)，空腹進行采取外周靜脈采血1 mL，保存在含有EDTA-K2 抗凝劑的采血管內(nèi)，并且6 h 內(nèi)進行處理，要求樣本白細胞計數(shù)應(yīng)在4.0 ～10.0 × 109/L 之間。若＞10.0×109/L，樣本需要稀釋，用PBS 稀釋；若＜4.0 × 109/L，應(yīng)分離單個核細胞。注意冷凍的標本或溶血的標本不能用。

1.3 流式細胞學實驗將5 μL CD45-PC7和CD24-PE、CD19-ECD 和CD27-PC5（均購自于美國貝克曼庫爾特公司）各10 μL比例混合，2 ～8 ℃避光保存。取流式管1 支，加入已配制好的混合熒光抗體35 μL。向管中加入50 μL混勻的外周EDTA 抗凝全血，進行混勻，避光，室溫孵育15 min。加入紅細胞裂解液OptiLyse C 300 μL，混勻，避光，再室溫孵育10 min。加入2 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），1 500 r/min，離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.4 流式細胞數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析采用Kaluza分析軟件，通過CD45-PC7/SSC 散點圖設(shè)門獲取10 000 個淋巴細胞，根據(jù)B 淋巴細胞表達CD19+特點，采用CD19-ECD/SSC 散點圖設(shè)門并分析CD19+淋巴細胞占淋巴細胞的百分比，同時用CD24-PE、CD27-PC5 對CD19+淋巴細胞進行標記，分析CD19+CD24hiCD27+這類細胞群占CD19+淋巴細胞的百分比。

1.5 統(tǒng)計學方法采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計學處理。先將各組數(shù)據(jù)采用Kolmogorov-Smirnov Test 進行正態(tài)檢驗，定量資料以均數(shù)±標準差表示，2組間比較采用獨立t檢驗，3組或3組以上數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA）。如為非正態(tài)性數(shù)據(jù)，2 組數(shù)據(jù)應(yīng)用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗。相關(guān)性不滿足正態(tài)分布條件運用Spearman 秩相關(guān)。檢驗水準以P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血Breg 細胞水平比較正常健康育齡女性早孕組外周血CD19+CD24hiCD27+Breg細胞占CD19+B 細胞百分比較非孕組明顯升高，差異具有顯著性（P= 0.007）。非孕期RSA 患者外周血CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞占CD19+B 細胞百分比低于非孕期正常健康育齡女性，差異具有統(tǒng)計學意義（P= 0.027）；早孕期RSA 患者外周血CD19+CD24hiCD27+Breg 細 胞 占CD19+B 細 胞 百 分比同樣低于早孕期正常健康育齡女性，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.038）。見表1、圖1 ～3。

2.2 Breg 細胞與淋巴細胞亞群的關(guān)系RSA 患者外周血CD19+CD24hiCD27+Breg 百分比與外周血CD3+CD4+T 淋巴細胞百分比呈正相關(guān)（r=0.226，P= 0.04），與CD3+CD8+T 淋巴細胞、CD16+CD56+NK 細胞百分比無相關(guān)性（r= 0.014，P=0.899；r=-0.099，P=0.374），見圖4。

表1 各組外周血CD19+CD24hi CD27+Breg 細胞水平比較Tab.1 Comparison of peripheral blood CD19+CD24hi CD27+Breg cells in RSA patients and normal controls ±s

表1 各組外周血CD19+CD24hi CD27+Breg 細胞水平比較Tab.1 Comparison of peripheral blood CD19+CD24hi CD27+Breg cells in RSA patients and normal controls ±s

注：表格P 值為與正常非孕組比較所得；a 為RSA 早孕組與正常早孕組比較：P=0.038 ＜0.05

組別正常非孕組正常早孕組RSA 非孕組RSA 早孕組例數(shù)30 28 31 55 CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞占CD19+B 細胞百分比（%）19.55±7.03 25.81±9.62 14.96±8.65 20.37±11.79a P 值0.007 0.027

圖1 各組外周血CD19+CD24hi CD27+Breg 細胞水平比較（均*P ＜0.05）Tab.1 Comparison of peripheral blood CD19+CD24hi CD27+Breg cells in RSA patients and normal controls

圖2 流式細胞學分析流程代表圖Tab.2 Representative figure of flow cytometry analysis

3 討論

母胎之間復(fù)雜的免疫耐受只有維持“恰當”的免疫平衡，才有利于維持正常的生理妊娠現(xiàn)象，而Breg 細胞在妊娠狀態(tài)下維持免疫耐受有重要作用［13］。本研究從人體外周血真實世界入手，發(fā)現(xiàn)正常早期妊娠組外周血CD19+CD24hiCD27+Breg百分比明顯高于非孕期組（P＜0.05），初步觀察到外周血Breg 細胞水平在機體妊娠后有所上升的現(xiàn)象，提示CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞可能參與維持機體生理妊娠的免疫耐受狀態(tài)。但妊娠狀態(tài)下，Breg 細胞水平發(fā)生改變的原因尚不明確。妊娠是機體一個生殖免疫的轉(zhuǎn)折點，有研究表明兩大重要的調(diào)控激素即雌激素（E2）和孕激素（P4）相互協(xié)調(diào)，能增加CD19+B 淋巴細胞的數(shù)量、刺激B 細胞成熟，減輕腦脊髓膜炎（encephalomyelitis，EAE）模型小鼠的病情［14-15］。此外，人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）作為妊娠特異激素，Rolle等發(fā)現(xiàn)95%CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞表面表達有hCG受體［12］。FETTKE 等［18］也發(fā)現(xiàn)絨毛滋養(yǎng)層內(nèi)的hCG能誘導(dǎo)CD19+CD24hiCD27+Breg細胞比例顯著增加，并且促進IL-10 的分泌，參與免疫功能［16］。而且，hCG還能促進產(chǎn)生特定妊娠保護性抗體漿細胞的生成［17］。由此推測，在妊娠狀態(tài)下，孕婦體內(nèi)的三大激素明顯上升，可能激活Breg 細胞的變化，參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，維持胚胎的免疫耐受［13，18］。

人體內(nèi)存在一種記憶型的CD24hiCD27+Breg細胞，其數(shù)量變化及功能研究近年在多種疾病中受到關(guān)注［12，19-20］。近年Guzman-Genuino 等回顧了先前關(guān)于Breg 細胞在自身免疫、移植（促進耐受）和癌癥（促進腫瘤生長）中潛在的機制也可能在妊娠期間發(fā)生，以便更好地理解Breg 細胞在建立和維持妊娠中母之間的免疫耐受作用［18］。Rolle 的研究中表明流產(chǎn)患者血清微環(huán)境不利于Breg 細胞的擴增，而且從流產(chǎn)患者分離的外周血CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞進行體外培養(yǎng)時，不能高效率分泌IL-10，這提示流產(chǎn)患者Breg 細胞不僅數(shù)量上欠缺而且功能上出現(xiàn)障礙［12］。本研究進一步從URSA疾病進行探討，結(jié)果表明RSA 患者外周血CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞水平無論在非孕期還是早孕期均低于對照組，初步提示CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞可能參與RSA 的發(fā)病機制。這也表明對于RSA 患者可能需要在受孕前開始調(diào)整機體的免疫狀態(tài)再受孕，受孕后繼續(xù)使用安胎措施來維持免疫平衡，減少再發(fā)流產(chǎn)的風險。這些與喬杰教授提出的要重視復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性的孕前管理，促使再次成功妊娠的理念是一致的［21］。

圖3 各組外周血CD19+CD24hi CD27+Breg 細胞水平流式表達個例代表圖Tab.3 Representative expression of peripheral blood CD19+CD24hi CD27+Breg cells by flow cytometry in RSA patients and normalcontrols

圖4 RSA 患者外周血CD19+CD24hi CD27+Breg 細胞百分比與免疫細胞亞群的相關(guān)性Tab.4 Correlation of CD19+CD24hi CD27+Breg cells with immune cell subsetsin RSA patients

CD3+CD4+T 淋巴細胞是一種輔助性型淋巴細胞（Th），具有Th1 和Th2 細胞兩種不同的功能亞型。研究［22］發(fā)現(xiàn)，Th2 細胞優(yōu)勢環(huán)境對妊娠有利，而Th1 細胞因子對妊娠有害，可導(dǎo)致不良妊娠。既往研究［23］表明RSA 患者體內(nèi)CD4+T 細胞被激活增多，表現(xiàn)為Th1 細胞在RSA 患者外周血及脫膜中表達明顯升高，使母胎免疫應(yīng)答過于強烈而引發(fā)流產(chǎn)。有學者在體外細胞培養(yǎng)層面發(fā)現(xiàn)健康人群提取的CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞能抑制CD4+T 淋巴細胞的免疫應(yīng)答，當Breg 細胞比例水平下降，CD4+T 淋巴細胞免疫應(yīng)答過于亢進，而導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展，而從患者體內(nèi)提取的CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞卻沒有此功能［12，20］。本研究進一步觀察到RSA 患者外周血CD19+CD24hiCD27+Breg細胞百分比與CD3+CD4+T 淋巴細胞比例呈一定正相關(guān)，即提示RSA 患者外周血CD3+CD4+T 淋巴細胞比例對Breg 細胞的水平變化更敏感，CD3+CD4+T 淋巴細胞比例上升，Breg 細胞水平隨著升高。本研究不同點在于，觀察RSA 患者體內(nèi)真實的免疫狀況，當機體處于免疫亢進狀態(tài)，為了維持免疫平衡，抑制型的細胞（包括Breg 細胞）會相應(yīng)地升高，故提示可能RSA 患者體內(nèi)免疫越亢進，CD4+T 淋巴細胞激活越明顯，這種微環(huán)境改變下外周血CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞受刺激誘導(dǎo)數(shù)量也隨著增多，從而參與維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和免疫平衡。但可能如同本研究發(fā)現(xiàn)RSA 患者外周血Breg 細胞仍較正常健康女性產(chǎn)生不足，或甚至可能存在功能障礙，難以維持免疫耐受而增加再次流產(chǎn)的風險。

綜上所述，本研究結(jié)果初步提示CD19+CD24hiCD27+Breg 細胞可能參與維持正常妊娠母胎免疫耐受的生理現(xiàn)象，推測妊娠這一事件對Breg 細胞有刺激誘導(dǎo)擴增作用，但RSA 患者體內(nèi)的微環(huán)境不足以充分激活Breg 細胞的擴增，最終可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)過于激烈，難以維持妊娠的免疫耐受而參與RSA 的發(fā)病機制，但在生物功能學如何介導(dǎo)RSA 的發(fā)病機制有待深入研究。