李旺輝 蘇達永 強瑞雪 郝志宏 于 力

1.廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院兒科（廣東廣州 510730）；2.廣州市第一人民醫(yī)院兒科（廣東廣州 510180）

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是兒科常見的疾病，可分為激素敏感型腎病綜合征（steroid -sensitive nephrotic syndrome，SSNS）和激素耐藥型腎病綜合征（steroid-resistant nephrotic syndrome，SRNS）[1]。SRNS患兒預后差，反復遷延不愈者最終發(fā)展至終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD），需要腎替代治療[2]，是臨床中非常棘手的問題。因此，尋找導致SRNS根源一直是研究的熱點。目前已明確多種基因突變可導致SRNS，尤其是編碼足細胞骨架分子相關(guān)蛋白的單基因突變在SRNS 中發(fā)揮重要的作用[3-6]。目前研究表明，8 個不同的單基因突變能夠?qū)е耂RNS，包括NPHSl，NPHS 2，WT 1，ACTN4，CD2AP，TRPC6，LAMB2，PLCE1等。其中PLCE1基因則是近年新發(fā)現(xiàn)的與兒童SRNS相關(guān)的基因[7-8]。文章總結(jié)1 例因PLCE 1基因突變致SRNS 患兒的臨床特征和基因變異的特點，并復習相關(guān)文獻。

1 臨床資料

患兒，女，2009年2月出生，起病年齡2歲，臨床診斷為PNS。父母親體健，非近親婚配；否認家族遺傳性疾病史。患兒因PNS 多次復發(fā)，先后采用激素、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A、他克莫司和嗎替麥考酚酯等治療，尿蛋白一直呈陽性，多次住院治療。5歲時第一次腎穿刺病理檢測為“系膜增生性腎小球腎炎（輕-中度）”；7 歲時第二次腎穿刺病理為“局灶節(jié)段性腎小球硬化（focal and segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）”。常規(guī)詢問病史、體格檢查、乙肝血清學檢查、淋巴細胞CD 系列檢測、血糖、胸透及心電圖檢查結(jié)果，除外其他系統(tǒng)疾病。尿沉渣中蛋白質(zhì)＋＋＋、紅細胞30～50/HP，白細胞2～5/HP；24小時尿蛋白定量7 428 mg/d。

考慮患兒原發(fā)性腎病綜合征起病年齡小，頻繁復發(fā)，激素耐藥，腎臟病理為FSGS，多種免疫抑制劑聯(lián)合治療效果不佳，激素不良反應增加?；純? 歲時經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準、監(jiān)護人簽署知情同意書后，抽取患兒及其父母各2 mL 外周血，置EDTA 抗凝管中混勻，送嘉檢醫(yī)學檢驗有限公司行腎病綜合征磷脂酶Cε1 (phospholipase C epsilon-1，PLCE1) 基因外顯子DNA 檢測，并結(jié)合患兒臨床特征、突變預測、突變位點正常人頻率、突變類型等，采用Sanger測序方法驗證患兒及其父母相關(guān)的基因變異位點。

基因序列分析顯示，患兒外周血細胞檢測到PLCE1基因的兩個雜合變異c.577G＞A（p.V193I）和c.2770G＞A（p.G924S），見圖1。Sanger 測序驗證顯示，c.577G＞A（p.V193I）基因變異來自患兒母親（雜合狀態(tài)）；患兒父母均無c.2770G＞A（p.G924S）基因變異，為新發(fā)突變。c.577G＞A（p.V193I）和c.2770G＞A（p.G924S）變異均為罕見的錯義變異，曾在相關(guān)PNS病例中被報道，為致病性變異（PMID24533735）。到目前為止，這2個變異在參考人群基因數(shù)據(jù)庫中頻率較低，變異所在區(qū)域不同物種的氨基酸序列中度保守，分析預測這2個變異可能影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能?；純鹤罱K確診為PNS（腎炎型，激素耐藥型，PLCE1基因突變）。明確診斷后，患兒應用糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素A治療，并獲得緩解。

2 討論

PLCE1基因定位于常染色體10q23.32-q24.1，全長297581 bp，共含有33 個外顯子。其編碼蛋白為磷脂酶Cε 1（phospholipase C epsilon-1，PLCε 1）。PLCε 1 蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的一種磷脂酶C（phospholipase C，PLC）同工酶，在成熟的腎小球足細胞表達，參與腎小球毛細血管袢的形成和正常發(fā)育[9]。近來發(fā)現(xiàn)，PLCEl基因突變可以引起常染色體隱性遺傳性腎病綜合征。PLCEl基因移碼或無義突變可導致嬰兒早發(fā)性腎病綜合征，其病理特征為彌漫性腎小球硬化（diffuse mesangial sclerosis，DMS）；而錯義突變可導致FSGS[10]。2006年研究者揭示了PLCE1基因的結(jié)構(gòu)，并用全基因組連鎖分析的方法證實PLCE1基因的突變導致家族性常染色體隱性遺傳型腎病綜合征以來，共發(fā)現(xiàn)了13種PLCE1基因突變可導致SRNS，這13 種突變可分為5 種類型：4 種無義突變、5 種堿基小缺失、1種堿基小插入、1種錯義突變和2種剪接突變，分別發(fā)生在PLCE1基因第2、3、10、14、16、18、21、24、25、29外顯子和第9、14內(nèi)含子上[11]。據(jù)報道，13種突變均為點突變，尚未發(fā)現(xiàn)基因的重組或大片段缺失[12]。

圖1 PLCE1 基因驗證測序圖

研究發(fā)現(xiàn)，純合的PLCE1突變可導致腎臟發(fā)育異常并減少蛋白podocin和nephrin的表達而增加發(fā)生腎病綜合征的易感性[13]；也有學者認為突變的PLCE 1可降低足細胞遷移率誘發(fā)類固醇抵抗性腎病綜合征[14]。雖然目前對于PLCE1造成腎病綜合征的具體機制尚不清楚，但眾多的研究已讓人們對不同類型PLCE 1突變致病特點有了初步的了解。具有PLCEl基因純合移碼或無義突變可導致PLCE 1酶功能缺乏使腎小球發(fā)育停止，導致腎臟形態(tài)學或功能異常，引起早發(fā)性的DSM；PLCEl基因純合錯義突變可導致PLCE1酶活性下降而使腎小球血管慢性損傷，引起發(fā)病較晚的FSGS[15]。DMS是先天性腎病綜合征的特殊類型，其主要臨床特征為出生后1年內(nèi)發(fā)病，常于5歲前迅速進展至終末期腎衰竭，而FSGS 蛋白尿的初發(fā)年齡相對較晚，進展到ESRD的時間較DMS慢。目前對于突變的PLCE 1導致DMS 的觀點尚有爭議，有研究認為PLCE1突變是導致DMS的主要因素，但也有研究發(fā)現(xiàn)2例激素耐藥型腎病綜合征兒童的父親同時也被發(fā)現(xiàn)有同樣的PLCE1基因突變,但其父親均無腎病綜合征表現(xiàn)，故不排除其他致病基因可能[12]。

臨床實踐發(fā)現(xiàn)，利用全外顯子組測序檢測PLCE1在診斷類固醇抵抗性腎病綜合征及其治療中有重要的實用價值。國外研究顯示，PLCE 1、NPHS 2和SMARCAL1是檢測到的最常見的基因變異[16]。然而國內(nèi)研究顯示，PLCE1變異發(fā)現(xiàn)率僅為5.6%[17]，NPHS1和PLCE1可能是最常見的變異類型[18]。PLCE1基因變異所致SRNS具有一定的家族遺傳性及年齡分布特點。研究顯示，0～6歲的SRNS患兒中可檢出PLCE1變異，其中以3～12 月齡檢出率最高，而6 歲后再無PLCE 1變異檢出[19]。因此，PLCE 1基因變異所致的SRNS 具有一定的早發(fā)性，且臨床病理以DMS 和FSGS 為主，大多對激素和各種免疫抑制劑耐藥且預后較差，其原因可能是PLCE 1基因變異區(qū)位于EF 手型(EF-hand)結(jié)構(gòu)域；結(jié)構(gòu)域上，而EF結(jié)構(gòu)域中的第1021～1030個氨基酸是金屬離子結(jié)合的位點，主要參與酶的催化合成，當PLCE1基因發(fā)生變異時，機體無法完成正常的蛋白翻譯，容易產(chǎn)生SRNS[20-21]。以往報道，由基因變異引起的腎病綜合征患兒對糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑治療都無明顯效應。如PLCE 1基因錯義變異所致的2 例SRNS 患兒的發(fā)病年齡分別為2歲和8歲10月齡，且分別于5歲和 12歲進展到ESRD[22]；亦有攜帶PLCE 1基因無義變異的腎病綜合征患兒對激素或環(huán)孢素A 治療有效報道[13]。提示PLCE 1變異引起的腎病綜合征對糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素有一定的敏感性，但其藥物作用機制尚不明確。

本例患兒為PNS，激素耐藥型?；純浩鸩∧挲g小，從最初的頻繁復發(fā)到激素耐藥，腎臟病理為FSGS，多種免疫抑制劑聯(lián)合治療效果不佳，激素的不良發(fā)育增加?；純篜LCE1基因存在2個雜合錯義變異 c.577G＞A（p.V193I）和c.2770G＞A（p.G924S），其中c.577G＞A（p.V 193 I）來自患兒母親（雜合變異），c.2770 G＞A（p.G 924 S）為新發(fā)變異，均為已報道的致病性變異。這2個變異在參考人群基因數(shù)據(jù)庫中頻率較低，變異所在區(qū)域不同物種的氨基酸序列中度保守，預測這2個變異可能影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，使患兒激素耐藥，多種免疫抑制劑效果不佳；因隨訪期限尚不足，其遠期預后尚不明確。

PLCE 1變異可導致早發(fā)性腎病綜合征，在所有具有基因純合移碼的個體中，其腎臟病理為DMS；而在具有錯義變異的個體中，其腎臟病理則表現(xiàn)為FSGS，因此PLCE1變異可導致從嚴重的早發(fā)性DMS到FSGS 的一系列組織學表型。腎臟病理為DMS 的PLCE 1變異的個體的腎小球未成熟，且腎組織中Nephrin與Podocin蛋白表達也會降低，表明PLCE1對于毛細血管環(huán)階段的腎小球的正常發(fā)育至關(guān)重要[23]。值得注意的是，PLCE1變異引起的PNS對糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素有一定的敏感性。這可能是由于在腎小球發(fā)育過程中存在著關(guān)鍵時間窗，而在此期間使用糖皮質(zhì)激素或環(huán)孢菌素A 治療可以改善PLCE 1功能喪失所帶來的腎小球發(fā)育缺陷。因此，這種治療方式僅僅適用PLCEl基因純合移碼或無義變異所導致的早期彌漫性腎小球硬化而不是錯義變異的PLCE 1導致的晚發(fā)性腎病綜合征局灶節(jié)段性腎小球硬化。這可能意味著錯義變異的PLCE 1等位基因能夠保證腎小球的適當發(fā)育，但在兒童后期可能會干擾腎小球修復過程，從而導致晚期局灶節(jié)段性腎小球硬化。這種延緩發(fā)病過程可能會導致治療關(guān)鍵時間窗喪失。后續(xù)研究需要對具有PLCE 1變異的個體及其治療反應進行評估從而證實這些假設。

激素耐藥型腎病綜合征的治療臨床工作中的重點難點，本例患兒起病后尿蛋白一直呈陽性，多次住院治療無改善，經(jīng)明確為PLCE1基因變異后使用糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢菌素A 治療，病情好轉(zhuǎn)。故針對SRNS患兒應盡早行腎穿刺明確病理類型，基于病理類型選擇更有效的免疫抑制劑的治療。針對早發(fā)型腎病綜合征及SRNS 兒童應考慮到基因突變誘發(fā)可能，盡早行基因檢測和變異位點分析，找出致病基因特點，對臨床診斷和判斷預后有重要意義。