張傳惠

(濰坊英軒實業(yè)有限公司，山東 濰坊 262499)

氨基葡萄糖(氨糖)，化學名稱為2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，是蛋白質多糖的重要組成部分，具有較高的親水性[1]，它也是軟骨細胞形成的重要營養(yǎng)物質，是軟骨基質和關節(jié)液的基本組成成分。工業(yè)用氨糖產品主要有氨糖鹽酸鹽和氨糖硫酸鹽，被廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)療保健和制藥行業(yè)[2-5]。氨糖的最大市場是北美、歐洲、亞洲和大洋洲，全球的氨糖總產能已經超過3萬t[6-8]，中國是全球最大的氨糖生產商[9]。

氨糖主要是由蝦蟹殼來源的幾丁質或菌體來源的幾丁質經化學法提取獲得，目前以葡萄糖為原料直接經過基因工程菌株發(fā)酵生產也已經日漸成熟。但蝦蟹殼來源的氨糖存在過敏原及重金屬等問題，發(fā)酵氨糖存在轉基因問題，而菌體來源特別是經玉米發(fā)酵檸檬酸獲得的黑曲霉菌體來源的氨糖則被公認為是目前最受歡迎的氨糖產品。然而隨著檸檬酸發(fā)酵菌渣作為飼料原料的應用，其作為氨糖生產原料的成本不斷提高，加之我國對環(huán)保的重視，菌體來源的氨糖產量不斷降低。所以，迫切需要開發(fā)菌體來源氨糖的生產新工藝。

作者采用高效、低成本的汽爆預處理工藝[10-11]對檸檬酸發(fā)酵菌渣進行預處理，考察不同汽爆預處理條件對化學法制備氨糖鹽酸鹽的影響，研究汽爆預處理過程中產生的可溶性副產物的綜合利用，以期通過高效的預處理手段增加菌體幾丁質相對含量，提高菌體氨糖收率，降低化學品消耗，為檸檬酸行業(yè)的副產物綜合利用及菌體氨糖的生產新工藝提供借鑒。

1 實驗

1.1 材料與儀器

檸檬酸發(fā)酵菌渣、黑曲霉菌種、檸檬酸發(fā)酵玉米培養(yǎng)基，均由濰坊英軒實業(yè)有限公司提供。

QBS-2008型汽爆設備，由5L反應室、蒸汽發(fā)生器和收集器組成，由鶴壁正道生物能源有限公司提供。

1.2 檸檬酸發(fā)酵菌渣的汽爆預處理

處理前，將檸檬酸發(fā)酵菌渣樣品的含水率調至30%，處理量為1 kg，處理時間為90 s，汽爆壓力分別為1.0 MPa、1.5 MPa、2.0 MPa、2.5 MPa。處理后樣品被瞬間排放到收集器中[12]，將收集器中的所有樣品(包括液體)全部收集到樣品收集袋中，105 ℃烘干至恒重(以下簡稱汽爆菌渣)，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 氨糖鹽酸鹽的制備

參照文獻[13]，取10 g汽爆菌渣，加入到25 mL 30%濃鹽酸中，95 ℃反應2 h，過濾，收集濾液，105 ℃烘干至恒重，即得氨糖鹽酸鹽。稱重，計算氨糖鹽酸鹽的收率。

1.4 氨糖鹽酸鹽純度的檢測

稱取0.5 g氨糖鹽酸鹽溶于5 mL去離子水中，采用高效液相色譜法測定峰面積，通過峰面積的比值計算氨糖鹽酸鹽的純度。色譜條件：柱溫為65 ℃、流動相為5 mmol·L-1硫酸、流速為0.6 mL·min-1，檢測器為示差檢測器[14]。

1.5 汽爆預處理副產物的分析

取5 g汽爆菌渣，加入到20 mL去離子水中，充分混合均勻，過濾，分別采用菲林試劑法和福林-酚試劑法檢測濾液中的可溶性總糖和可溶性總蛋白的含量。

2 結果與討論

2.1 汽爆預處理對檸檬酸發(fā)酵菌渣外觀的影響

在汽爆壓力分別為1.0 MPa、1.5 MPa、2.0 MPa、2.5 MPa時，對檸檬酸發(fā)酵菌渣進行汽爆預處理，通過比較汽爆菌渣的顏色來考察汽爆預處理對檸檬酸發(fā)酵菌渣外觀的影響，結果如圖1所示。

圖1 汽爆預處理對檸檬酸發(fā)酵菌渣外觀的影響Fig.1 Effect of steam explosion pretreament on appearance of citric acid fermentation residue

由圖1可知，汽爆預處理對檸檬酸發(fā)酵菌渣外觀的影響很大。檸檬酸發(fā)酵菌渣經過汽爆預處理后，其顏色變深，且隨著汽爆壓力的增大，菌渣的顏色不斷加深。這可能是因為，汽爆壓力越大，作用溫度越高，菌渣中蛋白與殘?zhí)堑拿览潞肿兎磻絼×?，導致菌渣的顏色越深?/p>

2.2 汽爆預處理對檸檬酸發(fā)酵菌渣中固形物含量的影響

將1.2所得汽爆菌渣稱重；充分洗滌，將可溶性物質洗滌干凈后再次烘干至恒重，稱重；計算總不溶性固形物含量，考察汽爆預處理對檸檬酸發(fā)酵菌渣中總不溶性固形物含量的影響，結果如圖2所示。

圖2 汽爆預處理對檸檬酸發(fā)酵菌渣中總不溶性固形物含量的影響Fig.2 Effect of steam explosion pretreatment on content of total insoluble solids in citric acid fermentation residue

由圖2可知，經過汽爆預處理的檸檬酸發(fā)酵菌渣中總不溶性固形物含量較未經汽爆預處理的少；且隨著汽爆壓力的增大，菌渣中總不溶性固形物含量不斷減少，在2.5 MPa下汽爆預處理90 s后的總不溶性固形物含量降至69.6%，較未經汽爆預處理的降低了25.64%。表明，汽爆預處理可以對菌渣起到很好的破碎作用，增加菌渣中可溶性固形物含量，這可能與菌體胞內成分釋放增加有關，且隨著汽爆壓力的增大，菌渣中可溶性成分釋放越徹底。

2.3 汽爆預處理對氨糖鹽酸鹽收率的影響

在不同壓力下對檸檬酸發(fā)酵菌渣進行汽爆預處理，按1.3方法制備氨糖鹽酸鹽，計算收率，結果見表1。

表1 汽爆預處理對氨糖鹽酸鹽收率的影響

Tab.1 Effect of steam explosion pretreatment on yield of glucosamine hydrochloride

由表1可知，檸檬酸發(fā)酵菌渣經過汽爆預處理后，氨糖鹽酸鹽收率較未經汽爆預處理的明顯升高；且隨著汽爆壓力的增大，氨糖鹽酸鹽收率不斷升高，在2.5 MPa下汽爆預處理90 s的氨糖鹽酸鹽收率較未經汽爆預處理的提高了(88.89±7.32)%。從化學品消耗的角度來看，檸檬酸發(fā)酵菌渣經汽爆預處理后，生產同等產量的氨糖鹽酸鹽，可減少鹽酸用量(88.89±7.32)%，減少廢棄物排放(88.89±7.32)%。

所制備的氨糖鹽酸鹽的HPLC圖譜如圖3所示。

由圖3可知，所制備的氨糖鹽酸鹽的雜質較少，純度達到了93.14%。表明，汽爆預處理有利于檸檬酸發(fā)酵菌渣中菌體氨糖的化學提取，可能是汽爆預處理增加了殘留固體中菌體幾丁質的相對含量。

圖3 氨糖鹽酸鹽的HPLC圖譜Fig.3 HPLC spectrum of glucosamine hydrochloride

2.4 汽爆預處理對檸檬酸發(fā)酵菌渣中可溶性總糖和可溶性總蛋白含量的影響(圖4)

由圖4可知，經過汽爆預處理的檸檬酸發(fā)酵菌渣中可溶性總糖和可溶性總蛋白的含量較未經汽爆預處理的明顯增加；且隨著汽爆壓力的增大，可溶性總糖和可溶性總蛋白的含量均逐漸增加；在2.5 MPa下汽爆預處理90 s后的可溶性總糖和可溶性總蛋白的含量分別達到6.44%和9.37%，分別是未經汽爆預處理的4.41倍和8.01倍。表明，較高的汽爆壓力可以更徹底地促進菌體細胞的破裂和可溶性成分的釋放。

2.5 汽爆預處理副產物的回收利用

為了回收利用汽爆預處理過程中產生的可溶性總糖和可溶性總蛋白，將汽爆菌渣溶解過濾獲得的可溶性成分烘干，然后按不同比例(2%、4%、6%)添加至檸檬酸發(fā)酵玉米培養(yǎng)基中，在250 mL三角瓶中接種黑曲霉進行檸檬酸發(fā)酵，考察汽爆預處理產生的可溶性成分對檸檬酸發(fā)酵的影響，結果如圖5所示。

圖5 汽爆預處理產生的可溶性成分對檸檬酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of soluble components produced by steam explosion pretreatment on citric acid fermentation

由圖5可知，與正常的檸檬酸發(fā)酵相比，添加4%和6%汽爆預處理產生的可溶性成分后，檸檬酸酸度略有升高，但升高并不明顯，并未對檸檬酸發(fā)酵產生不良的影響。可能是因為，雖然汽爆菌渣中可溶性總糖及可溶性總蛋白的含量明顯增加，但總量并不多，且可發(fā)酵用可溶性總糖和可溶性總蛋白的占比未知，所以添加一定量的汽爆預處理產生的可溶性成分并不會對檸檬酸發(fā)酵產生不良影響，在實際生產中，這部分可溶性成分可以返回檸檬酸發(fā)酵的原料預處理工序進行調漿重新回收利用。

3 結論

通過測定外觀、固形物含量、可溶性成分含量及收率，研究了不同汽爆壓力下檸檬酸發(fā)酵菌渣的汽爆預處理效果，確定汽爆預處理工藝可以顯著提升氨糖鹽酸鹽的收率，降低化學品消耗和廢棄物排放。在2.5 MPa下對檸檬酸發(fā)酵菌渣汽爆預處理90 s，氨糖鹽酸鹽的收率較未經汽爆預處理提高了(88.89±7.32)%。同時汽爆預處理產生的副產物富含可溶性總糖和可溶性總蛋白，對檸檬酸發(fā)酵無不良影響，可以回收利用。本研究構建了一種檸檬酸發(fā)酵菌渣新的利用策略，同時也提出了一種提高菌體氨糖收率的預處理方法，為檸檬酸行業(yè)的廢棄物綜合利用和菌體氨糖的高效生產提供了借鑒。