韓吳琦，黃永麗

(1.開封市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 開封 475000； 2.河南大學(xué)淮河臨床學(xué)院，河南 開封 475000)

乳癖消片由鹿角、蒲公英、昆布、天花粉、雞血藤、三七、赤芍、海藻、漏蘆、木香、玄參、牡丹皮、夏枯草、連翹、紅花15味藥材組成，具有軟堅(jiān)散結(jié)、活血消痛、清熱解毒的功效[1]，是國(guó)家基本藥物、婦科常用藥品。三七是乳癖消片的主藥,為貴重藥材。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)三七含量測(cè)定僅以人參皂苷Rg1為指標(biāo)，為保證臨床用藥安全有效，完善乳癖消片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定乳癖消片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器-高效液相色譜(ELSD-HPLC)方法，以便更好地控制其質(zhì)量。

1 藥品、試劑與儀器

乳癖消片，規(guī)格0.3 g，河南大學(xué)淮河臨床學(xué)院自制，批號(hào)171211，180101，180201。對(duì)照品三七皂苷R1(批號(hào)110745-201017)、人參皂苷Rg1(批號(hào)110703-201027)和人參皂苷Rb1(批號(hào)110704-201122)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。水為超純水；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。UltiMate 3000液相色譜儀、Chromeleon7工作站，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；ELSD 2000ES蒸發(fā)光檢測(cè)器，美國(guó)Alltech公司產(chǎn)品； KQ-600DE型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品；CPA225D 電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

安捷倫 XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃。ELSD檢測(cè)：霧化室溫度36 ℃，漂移管溫度65 ℃，氮?dú)饬魉?5 psi/min。理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1計(jì)算應(yīng)不得低于3 000。分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μL、5 μL，供試品溶液10 μL，進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg1、三七皂苷R1和人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，用甲醇溶解制得分別含人參皂苷Rg12.0291 g/L、三七皂苷R10.5162 g/L和人參皂苷Rb11.8783 g/L的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液10 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得含人參皂苷Rg1、三七皂苷R1和人參皂苷Rb1對(duì)照品分別為0.202 9 g/L、0.0516 0 g/L和0.187 8 g/L的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取約1.0 g，放入具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，水浴加熱回流2 h，放冷后再稱其質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備

按照乳癖消片處方和制劑方法，制得不含三七飲的樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法，制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取供試品、陰性樣品和對(duì)照品的溶液各10 μL進(jìn)樣，結(jié)果供試品和混合對(duì)照品色譜中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的保留時(shí)間分別為 21，33，41 min，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，分離度良好(R>1.5)。見圖1。

1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1；A.混合對(duì)照品； B.乳癖消片供試品 ；C.陰性樣品圖1 3種樣品溶液的高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液1.0，3.0，5.0，8.0，10.0，15.0，20.0 μL，依次注入高效液相色譜儀，測(cè)定，求得人參皂苷Rg1、三七皂苷R1和人參皂苷Rb1的回歸方程分別為：Y=41 359 333.4X-335 919.8(r=0.996 6)，Y=13 984 339.7X-8 507.7(r=0.997 2)，Y=17 590 279.7X+172 539.6(r=0.998 1)；線性范圍依次為0.202 9～4.058 0 μg，0.051 6～1.032 0 μg、0.187 8～3.756 0 μg。結(jié)果表明:三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1分別在0.051 6～1.032 μg、0.202 9～4.058 μg、0.187 8～3.756 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)得三七飲片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的峰面積。結(jié)果：RSD分別為0.87%、1.68% 和0.17%。結(jié)果表明：儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)乳癖消片樣品6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，測(cè)定人參皂苷Rg1、三七皂苷R1和人參皂苷Rb1的含量。結(jié)果：RSD分別為1.84%、1.48%和0.59%。結(jié)果表明：方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按2.2.2項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，分別在制備0，2，4，8，10，12，24 h進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，記錄人參皂苷Rg1、三七皂苷R1和人參皂苷Rb1的峰面積。結(jié)果：RSD分別為1.91%、1.64%和1.55%。結(jié)果表明：供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(批號(hào)171211)6份，每份約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混合對(duì)照品溶液(分別精密量取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液3，5，10 mL，置200 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得)50 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制成加樣供試品溶液，測(cè)定人參皂苷Rg1、三七皂苷R1和人參皂苷Rb1的含量，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果：三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的平均回收率分別為97.73%、99.32%和99.03%，RSD分別為1.01%、1.37%和1.85%。結(jié)果表明：準(zhǔn)確度良好。

2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱取3批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果n= 6

3 討 論

《中華人民共和國(guó)藥典》2015版一部中乳癖消片、乳癖消膠囊的含量測(cè)定項(xiàng)下供試品的處理方法操作繁瑣，并且加熱回流時(shí)間長(zhǎng)，而本研究所用方法操作簡(jiǎn)便快速，分離效果好，結(jié)果準(zhǔn)確，節(jié)約了時(shí)間和試劑，可以為修改相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

《中華人民共和國(guó)藥典》2015版一部和大多數(shù)文獻(xiàn)[2-8]均以高效液相色譜色結(jié)合紫外分光光度法對(duì)乳癖消制劑中的人參皂苷類的成分進(jìn)行檢測(cè)，波長(zhǎng)在末端吸收范圍，容易造成復(fù)方制劑中其他的成分與待測(cè)成分之間互相干擾，影響色譜峰的分離效果和結(jié)果的準(zhǔn)確性。ELSD檢測(cè)器具有響應(yīng)信號(hào)不受其官能團(tuán)的影響的光學(xué)特性，響應(yīng)信號(hào)更靈敏[9～11]，故本文選擇HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定制劑中貴重藥材三七中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量。

本試驗(yàn)方法準(zhǔn)確快速，重現(xiàn)性好，基線平穩(wěn)，可同時(shí)測(cè)定乳癖消片中三七藥材的皂苷類主成分的含量，可更好地控制藥品質(zhì)量，還可為含三七的復(fù)方藥物制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。