魏 敏，曹莉婷，盧利霞，張久聰，李初誼，鄭 英，王俊科，李 斌，劉 鑫，王 盼，肖 梅，于曉輝

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院消化內(nèi)科，甘肅 蘭州 730050； 2.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院； 3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率已分別躍居我國惡性腫瘤的第4位和第2位[1]，嚴(yán)重威脅著國民健康。因此對于HCC發(fā)病機(jī)制的深入研究對于其早期預(yù)防、診斷及探索該病的治療靶點(diǎn)具有重要意義。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種主要由活化的T淋巴細(xì)胞分泌的可抑制巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞移動(dòng)的細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)過程中起著重要的作用。而近些年越來越多的研究也證實(shí)了MIF在多種腫瘤組織中高表達(dá)，MIF與相應(yīng)受體結(jié)合后，可通過激活一系列細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如PI3K/AKT、MAPK和G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)等，促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和遷移。c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)作為MAPK家族的主要成員之一，有JNK1、JNK2和JNK3三種亞型，眾多研究表明，JNK1在HCC的發(fā)生和發(fā)展中起著更為關(guān)鍵的作用。但目前尚無MIF與JNK1相關(guān)性的報(bào)道。故本研究主要通過免疫組化、原位雜交、Western blotting等實(shí)驗(yàn)方法檢測HCC癌組織、癌旁組織和肝癌細(xì)胞中MIF、JNK1、pJNK1、MIF mRNA和JNK1 mRNA的表達(dá)水平，并探討二者相互關(guān)系，為揭示HCC可能的發(fā)病機(jī)制提供思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院2018年1月至2019年12月收治的52例HCC患者手術(shù)切除的癌組織及相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤組織2.0 cm以上)，另收集20例肝血管瘤、肝破裂等手術(shù)患者的正常肝組織。全部病例臨床資料完整，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得患者及家屬知情同意。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制作成組織芯片石蠟塊，切片厚約4 μm。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑重組人MIF購自PeproTech公司(目錄號(hào)：300-69)，兔抗人MIF單克隆抗體(ab7207)、兔抗人JNK1的單克隆抗體及羊抗兔二抗(ab110724)購自Abcam公司，磷酸化兔抗人JNK1單克隆抗體購自CST公司(4668)，Total RNA提取(9108)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)及PCR反應(yīng)試劑盒(RR820A)均購自日本TaKaRa公司，L-O2正常肝細(xì)胞、HepG2肝癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫，胎牛血清購自Hyclone公司，1640培養(yǎng)基干粉和胰蛋白酶購自Gibco公司，四甲基偶氮唑藍(lán)、二甲基亞楓購自Sigma公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色使用免疫組化試劑盒對切片進(jìn)行免疫染色。載玻片在二甲苯中脫蠟，在濃度升高的乙醇中依次水化，然后在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中沖洗，用山羊血清阻斷10 min后。先用1∶80單克隆兔抗人MIF抗體工作液加在組織芯片上，室溫下孵育50 min，PBS沖洗后山羊血清阻斷10 min，加辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋倍數(shù)1∶80)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，肝細(xì)胞漿內(nèi)MIF陽性呈黃色或棕黃色細(xì)顆粒。JNK1、pJNK1(稀釋倍數(shù)均為1∶100)檢測步驟與MIF相同。

1.4 原位雜交石蠟組織芯片用二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度乙醇透明至PBS水洗，蛋白酶K消化(25 μg/ml)，37 ℃，20 min。在37 ℃的2×標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽(SSC)中洗滌后，將切片預(yù)雜交，然后在雜交緩沖液中分別與MIF寡核苷酸探針雜交，置濕盒內(nèi)37 ℃，24 h，然后在37 ℃的2×SSC、0.5×SSC及0.2×SSC洗滌，用堿性磷酸酶結(jié)合生物素化鼠抗地高辛片段檢測雜交探針，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。JNK1 mRNA的檢測步驟與MIF mRNA相同。

1.5 Real-time PCR用Trizol提取法提取總RNA，多功能酶標(biāo)儀檢測RNA純度和濃度，并通過TaKaRa PrimeScriptTMRT Master MIX(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行相對熒光定量檢測，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果轉(zhuǎn)換為2-ΔΔCT進(jìn)行分析。JNK1和GAPDH的引物購自Takara公司，所使用引物序列如下：JNK1：Sense：5′-CCTGGCAAGCACTACCTGGA-3′；Antisense：5′-CAAGCCACCTTGGTCTTGGA-3′；GAPDH：Sense：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′；Antisense：5′-TGGTGAAGACGCCAGTTGGA-3′。

1.6 Western blotting取不同濃度rMIF組的細(xì)胞并裂解，裂解產(chǎn)物在4 ℃離心取上清液，對總蛋白進(jìn)行定量及變性，按30 μg/孔總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳后并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂乳室溫封閉1 h，用JNK1(1∶1 000)兔抗人抗體4 ℃孵育過夜，TBST清洗后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗37 ℃溫育1 h，加化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，檢測JNK1的表達(dá)。pJNK1的檢測步驟同上。

1.7 免疫組織化學(xué)和原位雜交結(jié)果判斷陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色的顆粒，根據(jù)染色的廣度和強(qiáng)度進(jìn)行評分。在光學(xué)顯微鏡200倍下閱片，選擇無邊緣效應(yīng)、無組織折疊等影響讀片效果的典型部位，隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野，取每個(gè)視野內(nèi)的平均陽性細(xì)胞數(shù)作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師在雙盲下參照Axiotis病理評分標(biāo)準(zhǔn)[2]對免疫組化和原位雜交結(jié)果進(jìn)行閱片，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞占同類細(xì)胞總數(shù)的百分比綜合判定。染色程度分為4個(gè)等級(jí)：無陽性著色為0分，黃色或淺粉色為1分，棕黃色或粉色為2分，黃褐色或紅色為3分。陽性細(xì)胞占整張片比例評分標(biāo)準(zhǔn)：<10%為0分，10%～40%為1分，41%～70%為2分，>70%為3分。兩種評分相加：0～1分為陰性；2分為弱陽性；3～4分為陽性；5～6分為強(qiáng)陽性?！?分定為陰性，>2分定為陽性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用Pearson Chi-square (χ2檢驗(yàn))。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIF、JNK1和pJNK1蛋白在HCC中高表達(dá)通過免疫組織化學(xué)方法觀察各組組織中MIF、JNK1、pJNK1蛋白的陽性染色信號(hào)。其中MIF、JNK1蛋白在HCC癌組織和癌旁組織中均呈彌漫性或灶性分布，且均以胞漿表達(dá)為主，陽性染色信號(hào)呈棕黃色。而在正常肝細(xì)胞中二者呈陰性表達(dá)(見圖1)。MIF、JNK1在HCC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)與正常肝組織比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，HCC癌組織和癌旁組織間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。pJNK1陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核中，陽性染色呈棕褐色(見圖1)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，pJNK1在HCC癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常肝組織(P均<0.05)。在HCC癌組織中pJNK1表達(dá)呈陽性，且陽性率為67.31%(35/52)，在癌旁組織中表達(dá)呈可疑陽性，陽性率為44.23%(23/52)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而癌旁組織和正常肝組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色法檢測MIF、JNK1、pJNK1蛋白在HCC癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)(放大200倍) Fig 1 The expressions of MIF, JNK1 and pJNK1 proteins in HCC cancer tissues, adjacent tissues and normal liver tissues detected by immunohistochemistry

表1 MIF、JNK1和pJNK1蛋白在HCC癌組織、癌旁組織 和正常肝組織中的陽性表達(dá)率[n(%)]Tab 1 The positive expression rates of MIF, JNK1 and pJNK1 proteins in HCC cancer tissues, adjacent tissues and normal liver tissues [n(%)]

2.2 MIF mRNA和JNK1 mRNA在HCC中高表達(dá)通過原位雜交法檢測MIF mRNA、JNK1 mRNA在各組肝組織中的表達(dá)。MIF mRNA和JNK1 mRNA在HCC癌組織和癌旁組織中均呈陽性表達(dá)，且主要在細(xì)胞漿內(nèi)，陽性染色顆粒呈深棕色或棕黃色，在正常肝組織中呈陰性表達(dá)(見圖2)，兩種核酸在HCC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)均明顯高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，而在HCC癌組織和癌旁組織中，二者表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

圖2 原位雜交法檢測MIF mRNA、JNK1 mRNA在HCC癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)(放大200倍) Fig 2 The expressions of MIF mRNA, JNK1 mRNA in HCC cancer tissues, adjacent tissues and normal liver tissues detected by in situ hybridization

表2 MIF mRNA、JNK1 mRNA在HCC癌組織、癌旁組織和 正常肝組織中的陽性表達(dá)率[n(%)]Tab 2 The positive expression rates of MIF mRNA, JNK1 mRNA in HCC cancer tissues, adjacent tissues and normal liver tissues [n(%)]

2.3 rMIF可上調(diào)HepG2肝癌細(xì)胞中pJNK1的活性用不同濃度的rMIF(0 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml和200 ng/ml)作用于L-O2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24 h，通過Western blotting法檢測JNK1、pJNK1蛋白的表達(dá)情況。在HepG2細(xì)胞中，JNK1蛋白在rMIF不同濃度組的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。而pJNK1蛋白呈濃度依賴性增加，尤以rMIF濃度為200 ng/ml時(shí)表達(dá)最明顯。與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3～5)。

圖3 不同濃度rMIF對L-O2細(xì)胞中JNK1和pJNK1 表達(dá)量的影響

Fig 3 Effects of different concentrations of rMIF on the expression of JNK1 and pJNK1 in L-O2 cells

圖4 不同濃度rMIF對HepG2細(xì)胞中JNK1和pJNK1 表達(dá)量的影響Fig 4 Effects of different concentrations of rMIF on the expression of JNK1 and pJNK1 in HepG2 cells

注：與L-O2組比較，*P<0.05,**P<0.01; ***P<0.001, ****P<0.0001。圖5 不同濃度的rMIF作用下，pJNK1蛋白在L-O2、HepG2 細(xì)胞中的相對表達(dá)量

Fig 5 Changes in the relative expression of pJNK1 in L-O2 and HepG2 cells under the action of different concentrations of rMIF

2.4 rMIF可促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞中JNK1 mRNA的表達(dá)用不同濃度的rMIF(0 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml和200 ng/ml)作用于L-O2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24 h，通過RT-PCR技術(shù)檢測兩組細(xì)胞中JNK1 mRNA的表達(dá)。JNK1 mRNA在HepG2肝癌細(xì)胞和L-O2正常肝細(xì)胞中均有表達(dá)，但在HepG2肝癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于L-O2正常肝細(xì)胞，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；JNK1 mRNA的表達(dá)隨著rMIF濃度的遞增而增加，尤以rMIF濃度為200 ng/ml時(shí)表達(dá)最明顯，各濃度組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖6)。

注：與L-O2組比較，*P<0.05,**P<0.01; ***P<0.001, ****P<0.0001。圖6 RT-PCR法檢測不同濃度rMIF對L-O2細(xì)胞和 HepG2細(xì)胞中JNK1 mRNA表達(dá)的影響Fig 6 Effects of different concentrations of rMIF on the expression of JNK1 mRNA in L-O2 cells and HepG2 cells detected by RT-PCR

3 討論

MIF作為一類具有促炎和致癌雙重作用的多能細(xì)胞因子，在多種腫瘤細(xì)胞和組織中過表達(dá)且與疾病發(fā)病機(jī)制和病情進(jìn)展相關(guān)[3-5]。研究提示MIF可通過結(jié)合其細(xì)胞表面受體CD74，啟動(dòng)胞內(nèi)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)，包括PI3K/AKT、MAPK、NF-κB、HIF-1α等，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和存活。此外，MIF還能直接或間接調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因p53的功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)展[6-8]。而最近的多項(xiàng)研究表明，JNK作為MAPK家族中的一員，在MIF介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。如Liu等[9]在腺樣囊性癌組織中檢測MIF呈過度表達(dá)，且與pJNK的活化呈顯著負(fù)相關(guān)，用MIF特異性抑制劑ISO-1對腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-2進(jìn)行處理后，腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和遷移過程被顯著抑制，同時(shí)JNK活性明顯上調(diào)，從而提示MIF可能是通過下調(diào)JNK活性參與其惡性進(jìn)展。這與Varinelli等[10]的研究結(jié)果具有一致性，其研究表明在甲狀腺癌細(xì)胞中，應(yīng)用選擇性MIF抑制劑4-IPP可通過阻斷MIF/CD74內(nèi)化，激活JNK，呈劑量依賴性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和有絲分裂性細(xì)胞死亡，進(jìn)而抑制其增殖。此外，MIF還可通過激活或阻斷JNK信號(hào)傳導(dǎo)過程參與結(jié)直腸癌[11]、非小細(xì)胞肺癌[12]和膠質(zhì)瘤[13]的發(fā)生發(fā)展。而在HCC中，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究。

作者所在的研究團(tuán)隊(duì)既往研究結(jié)果提示，MIF作為銜接炎癥與腫瘤的關(guān)鍵橋梁，參與了乙肝-肝硬化-HCC發(fā)生與發(fā)展的全過程，且與肝臟組織損傷程度密切相關(guān)[14]，這也與近期國內(nèi)外研究報(bào)道一致[15-16]，但具體機(jī)制尚不明確。而JNK作為MAPK通路的一條亞通路，主要分為3種亞型。其中，研究表明JNK在肝癌組織中僅有兩種亞型，即：JNK1和JNK2，而大量的研究證實(shí)，相比于JNK2，JNK1才是人肝癌細(xì)胞體外增殖和異種移植后腫瘤發(fā)生所必需的[17]。如JNK1而不是JNK2是應(yīng)激誘導(dǎo)c-Jun磷酸化的主要激酶[18]，JNK1缺乏則可保護(hù)小鼠免受DEN誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡，從而降低肝癌的增殖和形成[19]。此外也有研究表明，JNK1的激活在人原發(fā)性肝癌中明顯增加，而JNK2的激活則不明顯[20]。綜上所述，JNK1在HCC的發(fā)生和發(fā)展中起著更為關(guān)鍵的作用。

上述研究結(jié)果提示MIF、JNK1均與HCC密切相關(guān)，然而關(guān)于MIF與JNK1的相關(guān)性及在HCC中作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究收集乙肝肝硬化基礎(chǔ)的HCC患者52例，取手術(shù)切除的癌組織及相應(yīng)的癌旁組織為實(shí)驗(yàn)組，同期取20例肝血管瘤、肝破裂手術(shù)切除標(biāo)本作正常對照，應(yīng)用免疫組化、原位雜交、Western blotting等實(shí)驗(yàn)方法檢測HCC癌組織、癌旁組織和肝癌細(xì)胞中MIF、JNK1、pJNK1、MIF mRNA和JNK1 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果提示MIF、JNK1、pJNK1和JNK1 mRNA在HCC癌組織和癌旁組織中的陽性表達(dá)率均明顯高于正常肝組織，且經(jīng)不同濃度的rMIF刺激后，HepG2肝癌細(xì)胞中pJNK1和JNK1 mRNA的相對表達(dá)量均呈濃度依賴性升高，從而提示MIF參與HCC進(jìn)展，可能是通過激活JNK1信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。

綜上，MIF、JNK1、pJNK1在HCC組織和HepG2肝癌細(xì)胞中呈高水平表達(dá)，MIF參與HCC發(fā)生與發(fā)展可能是通過激活JNK1信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的，這一研究結(jié)果可為以MIF為靶點(diǎn)的抗HCC新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。