楊學(xué)琴 毛鑫玉 陳鈺婷 李悅蘭 張 文

1（深圳市職業(yè)病防治院病理毒理所 深圳518020）

2（河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫專業(yè) 張家口075000）

隨著人類基因組計(jì)劃的推進(jìn)，研究環(huán)境對(duì)人類健康影響的環(huán)境毒理學(xué)進(jìn)入了毒理基因組學(xué)時(shí)代，從傳統(tǒng)的遺傳毒性檢測(cè)方法轉(zhuǎn)變?yōu)榛蚣簷z測(cè)方法，同時(shí)提高遺傳損傷效應(yīng)的檢測(cè)能力并降低檢測(cè)閾值［1］。電離輻射是環(huán)境物理因素對(duì)人類健康影響的研究熱點(diǎn)，對(duì)生物體的影響最為突出的分子機(jī)制表現(xiàn)為遺傳物質(zhì)的損傷。目前較為成熟的輻射遺傳損傷檢測(cè)主要有染色體畸變率分析和淋巴細(xì)胞微核分析。染色體畸變率分析是目前公認(rèn)準(zhǔn)確性高、較為可靠的“金標(biāo)準(zhǔn)”，實(shí)際應(yīng)用中存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)鏡檢人員技術(shù)要求較高，耗時(shí)耗力等不足之處［2-3］。淋巴細(xì)胞微核分析的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性與染色體畸變率分析的結(jié)果幾乎相當(dāng)，是染色體損傷快速初篩的試驗(yàn)方法，但也需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并且微核率易受年齡，生活方式和環(huán)境的影響，導(dǎo)致本底值升高［4］。隨著毒理基因組學(xué)的不斷發(fā)展，利用輻射敏感基因的集群檢測(cè)方法估算電離輻射對(duì)人類健康的影響將會(huì)有效提高檢測(cè)效率和敏感性。

利用生物學(xué)指標(biāo)確定已接受照射劑量的測(cè)定體系稱為生物劑量計(jì)，一個(gè)好的生物劑量計(jì)應(yīng)具備以下幾點(diǎn)［5］：對(duì)電離輻射有特異性或至少在正常人自發(fā)本底值較低；具有較高的靈敏度，且與照射劑量相關(guān)性較好；為整體與離體效應(yīng)一致；對(duì)大劑量急性照射和對(duì)小劑量累積照射均有較好的劑量–效應(yīng)關(guān)系；個(gè)體間變異??；方法簡(jiǎn)便，取材方便；測(cè)定方法快速，有可能借助儀器實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

傳統(tǒng)的染色體畸變率分析和淋巴細(xì)胞微核分析兩種方法對(duì)早期、快速、高效估算疑似受照人員劑量存在著方法本身的缺陷。本研究將從健康人群輻射敏感基因本底水平，健康人群與輻射接觸人群輻射敏感基因表達(dá)量的差異性，以及輻射敏感基因的劑量–效應(yīng)關(guān)系3個(gè)方面進(jìn)行探索。選擇 磷 脂 酰 肌 醇 聚 糖 -A 基 因（Phosphatidylinositolglycan-class A， Pig-a）、生長(zhǎng)阻滯和DNA 損傷誘導(dǎo)基因45（Growth arrest and DNA damage inducible 45， Gadd45α）及次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因（Hypoxanthine phosphoribosyltransferase， Hprt）3 個(gè)基因，以人體外周血為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)這3個(gè)基因的表達(dá)水平，對(duì)其是否能作為輻射損傷生物劑量計(jì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 外周血的采集與照射

選擇非放射從業(yè)健康人群（對(duì)照組）和放射從業(yè)人員（暴露組）各25名，收集其體檢血液2 mL，肝素鈉抗凝。研究對(duì)象符合中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)制定的《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法（試行）》（2007）的要求，并通過深圳市職業(yè)病防治院倫理審查委員會(huì)討論批準(zhǔn)。嚴(yán)格按照批準(zhǔn)的研究方案開展研究工作。

采集三名健康成年人（均無吸煙史與飲酒史，近期未接受X射線檢查等放射影響）外周血各25 mL，肝素鈉抗凝。將每份抗凝血平均分為5份，每份5 mL。照射條件：采用6 MV X射線機(jī)（Elekta Synergy，Linacd House， Fleming Way， Cawley， West Sussex PH10 2RR，UK），照射劑量率300 cGy/min，源靶距100 cm，照射野8.0 cm×8.0 cm。設(shè)置劑量為0Gy、0.10Gy、0.25Gy、0.50Gy、1.00Gy、2.00 Gy和5.00 Gy。 國(guó)際協(xié)調(diào)委員會(huì)（International Conference on Harmonization，ICH）頒布的指導(dǎo)原則S2（R1）受照細(xì)胞相對(duì)存活率不低于（55±5）%，每個(gè)劑量點(diǎn)至少重復(fù)3次［6］。將照射后的血樣置于37 ℃的培養(yǎng)箱中放置6 h后進(jìn)行mRNA的提取。

1.1.2 主要試劑和儀器

Red Cell Lysis Buffer（RT122-02）、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR118）、FastFire qPCR PreMix （SYBR Green）快速熒光定量PCR預(yù)混試劑盒（FP207-01）（北京TIANGEN 公司）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 血 液 總 RNA 提 取 試 劑 盒（11828665001）（瑞士Roche 公司）；Optical 8-Cap Strips for 0.2 mL tube strips/plates（TCS0803）（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Agarose， LMP， Preparative Grade for Large Fragments （＞1 000 bp）（V2831）（美國(guó)Promega 公司），Real Time PCR 儀（CFXConnect Bio-Rad 美國(guó)）。

1.1.3 基因引物

使用Olige 6 設(shè)計(jì)合成的引物序列見表1。正、反向引物序列為5′-3′。

表1 輻射敏感基因和內(nèi)參基因引物序列Table 1 Primer sequence of radiosensitive gene and internal reference gene

1.2 方法

1.2.1 全血總RNA 的提取

將采集外周血500 μL 加入1.5 mL RNase-free EP管中，然后加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，倒置混勻10 min，使血樣充分裂解，4 000 r/min 離心3 min，棄去上清液，加入200 μL PBS 緩沖液重懸。加入400 μL Lysis-/Binding Buffer，渦旋15 s。將樣品沿管壁緩慢移至組合好的反應(yīng)管上層，8 000 r/min離心15 s。棄去收集管廢液后重新組合過濾籃，每管加入混勻的90 μL DNase Incubaton Buffer、10 μL Dnase I，孵育15 min。加入500 μL Wash Buffer I，8 000 r/min 離心15 s。棄廢液后重新組合過濾籃，加入500 μL Wash Buffer Ⅱ，8 000 r/min 離心15 s。棄廢液后重新組合過濾籃，加入200 μL Wash Buffer Ⅱ，11 000 r/min 離心2 min。棄去收集管，將過濾籃插入1.5 mL RNase-free EP管中，加入75 μL Elution Buffer，13 000 r/min 離心1 min。將收集到的總RNA放入-20°C保存。

1.2.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

將-20 °C 保存的總RNA 取出，于冰上解凍。在冰上按照如下反應(yīng)體系配制所需反應(yīng)液的混合液：4 μL 的5×FastKing-RT SuperMix 和16 μL 的Total RNA；反應(yīng)條件：42°C，15 min；95°C，3 min。將所得cDNA放入-20°C保存。

1.2.3 利用RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

將-20°C保存的cDNA取出，于冰上解凍。為了保證體系反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，應(yīng)按照多于1個(gè)反應(yīng)數(shù)的進(jìn)行試劑配制，然后分裝到各個(gè)反應(yīng)管中，最后加入cDNA 樣品。反應(yīng)體系20 μL，設(shè)置3個(gè)檢測(cè)復(fù)孔。在冰上按照如下反應(yīng)體系配制所需反 應(yīng) 液 的 混 合 液：10 μL 的2×FastFire qPCR PreMix，正向引物（5 μmol/L）、反向引物（5 μmol/L）各1.2 μL，5 μL 的cDNA 模板，2.6 μL RNase-Free ddH2O，共20 μL 反應(yīng)體系；反應(yīng)條件：95 ℃1 min后進(jìn)行40 個(gè)95 ℃5 s、55 ℃10 s、72 ℃15 s 的循環(huán)。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度和純度（激發(fā)波長(zhǎng)分別為260 nm 和280 nm 時(shí)吸光度的比值，A260/A280值）。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析。輻射敏感基因本底水平統(tǒng)計(jì)分析采用平均值、波動(dòng)范圍（25%～75%）和變異系數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均數(shù)）描述本底水平在人群中差異程度。健康人群與輻射接觸人群敏感基因表達(dá)量差異性分析采用ΔCT（Threshold cycle，CT）方法，以看家基因Gapdh為內(nèi)參，配對(duì)t檢驗(yàn)分析兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。輻射敏感基因劑量–效應(yīng)研究利用2-△△CT法，計(jì)算各個(gè)敏感基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)水平，ΔCT=CT，目的基因-CT，內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT，照射組樣品-ΔCT，對(duì)照組樣品。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，二項(xiàng)式曲線回歸分析，p＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 人群樣本基本信息

對(duì)照組和暴露組均為25 人。暴露組平均年齡為36.12歲，其中男性為19人，女性為6人，平均暴露時(shí)間為111.52 d；對(duì)照組平均年齡為23.76歲，其中男性為18 人，女性為7人，平均暴露時(shí)間為0 d。對(duì)照組和暴露組匹配。

2.2 SYBR Green 熒光定量RT-PCR 擴(kuò)增特異性驗(yàn)證

熔解曲線分析顯示Gapdh、Gadd45α、Hprt、Pig-a 基因均為單峰，并且Pig-a 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳也顯示為單一條帶，表明PCR擴(kuò)增均為特異性的擴(kuò)增，見圖1。

圖1 Gapdh(a)、Gadd45α(b)、Hprt(c)與Pig-a(d)基因熔解曲線分析Fig.1 Analysis of Gapdh(a),Gadd45α(b),Hprt(c),and Pig-a(d)melting curves

2.3 輻射敏感基因本底水平統(tǒng)計(jì)分析

采集25 名非放射從業(yè)健康人員的外周血進(jìn)行輻射敏感基因本底水平分析。Pig-a 基因相對(duì)表達(dá)量的平均值為2.990，波動(dòng)范圍是2.595～3.882，變異系數(shù)18.73%；Gadd45α 基因相對(duì)表達(dá)量的平均值為6.470，波動(dòng)范圍是2.693～8.627，變異系數(shù)19.62%；Hprt 基因相對(duì)表達(dá)量的平均值為6.470，波動(dòng)范圍是4.894～8.627，變異系數(shù)24.49%。Piga、Gadd45α 基因的變異系數(shù)均在20%以內(nèi)，表明Pig-a、Gadd45α 基因在健康人群中本底水平差異較小，表達(dá)水平相對(duì)均一。Hprt 基因變異系數(shù)大于20%，表明在健康人群中本底水平差異較大，應(yīng)考慮剔除。

2.4 暴露組和對(duì)照組敏感基因相對(duì)表達(dá)量的比較

Gadd45α、Hprt、Pig-a 基因相對(duì)表達(dá)量見圖2。對(duì)照組與暴露組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hprt基因在對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量高于暴露組（t=2.105，p=0.046）；Gadd45α基因在對(duì)照組中相對(duì)表達(dá)量低于暴露組（t=4.762，p＜0.01）；Pig-a基因在對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量低于暴露組（t=2.441，p=0.022）。

圖2 對(duì)照組與暴露組中Gadd45α(a)、Hprt(b)與Pig-a(c)基因相對(duì)表達(dá)量（***p＜0.01，**p＜0.02，*p＜0.05，與對(duì)照組相比）Fig.2 Gene expression of Gadd45α(a)、Hprt(b)、Pig-a(c)in control and exposed groups(***p＜0.01,**p＜0.02,and*p＜0.05 compared with the control group)

2.5 X射線照射后Gadd45α、Hprt、Pig-a基因表達(dá)的劑量-效應(yīng)關(guān)系

如圖3 所示，X 射線照射6 h 后，人外周血淋巴細(xì)胞Gadd45α 基因表達(dá)隨著照射劑量的增加而上升，劑量和基因相對(duì)表達(dá)量擬合的二項(xiàng)式曲線為y=0.130 7x2+0.487 8x+1.251 8，相關(guān)系數(shù)為R2=0.989 7，曲線顯示在0.5 Gy時(shí)，Gadd45α基因表達(dá)上升幅度較大；Hprt 基因相對(duì)表達(dá)量在0～2 Gy 范圍內(nèi)隨著劑量的增加而上升，擬合曲線為y=0.577 2x2?0.175 4x+1.014 7，R2=0.975 1，在5 Gy 劑量點(diǎn)表達(dá)量下降；Pig-a 基因表達(dá)隨著照射劑量的增加而上升，y=0.363 5x2+0.176 4x+1.383 2，R2=0.995 8。經(jīng)SPSS 19.0 回歸分析檢驗(yàn)，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖3 輻射敏感基因Gadd45α(a)、Hprt(b)與Pig-a(c)劑量?效應(yīng)曲線擬合Fig.3 Dose?effect curves for radiation sensitive genes Gadd45α(a),Hprt(b),and Pig-a(c)

3 討論

核安全及輻射防護(hù)一直是環(huán)境保護(hù)與公共衛(wèi)生關(guān)注重點(diǎn)的領(lǐng)域之一。核事故發(fā)生后的早期，對(duì)疑似受照人員進(jìn)行受照劑量快速估算和分類診斷以及及時(shí)救治具有十分重要的意義。利用輻射敏感基因表達(dá)變化作為輻射損傷標(biāo)志物用于生物劑量估算的研究早已有報(bào)道［7-9］。將特定的基因圖譜改變與特定劑量或時(shí)間的毒性損傷表現(xiàn)相關(guān)聯(lián)［10］。這些輻射敏感基因涉及DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架組裝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因，并不局限于染色體損傷相關(guān)基因。這些敏感基因的改變包括表達(dá)量的變化和基因本身突變兩種。

Pig-a 基因位于人類X 染色體短臂Xp22.1，可編碼N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，參與糖基磷脂酰肌醇（GlycosyIphosphatidyl jnositol，GPI）連接蛋白的早期合成［11］。近年來Pig-a基因多用于Pig-a 突變?cè)囼?yàn)，這是一種反映體內(nèi)基因突變遺傳學(xué)終點(diǎn)的致突變?cè)囼?yàn)。Pig-a 基因的表達(dá)具有普遍性，目前多采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞系的Pig-a 基因突變［12-13］。但實(shí)時(shí)熒光定量PCR 不僅方法操作簡(jiǎn)單，并且能快速明了地對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，本次研究RT-qPCR的結(jié)果顯示Piga基因表達(dá)量隨著吸收劑量的增大而增加，具有一定的輻射敏感性，Pig-a 基因在健康人群的表達(dá)相對(duì)均一，波動(dòng)范圍較小，個(gè)體間變異?。惠椛浣佑|人群Pig-a基因的表達(dá)量高于健康人群，顯示出小劑量長(zhǎng)期照射對(duì)Pig-a基因表達(dá)的影響是刺激基因的表達(dá)；經(jīng)X 射線照射后，發(fā)現(xiàn)Pig-a 基因的表達(dá)量隨著照射劑量的增加而上升，具有很好的劑量?效應(yīng)關(guān)系。Pig-a基因在輻射接觸人群中表現(xiàn)出的表達(dá)量增加和X 射線急性照射后表達(dá)量變化趨勢(shì)相同，大劑量急性照射和小劑量累積照射均刺激Pig-a基因的表達(dá)。以上結(jié)果均顯示出Pig-a基因相對(duì)表達(dá)量的變化有可能作為生物劑量計(jì)，具有好的生物劑量的特點(diǎn)，相較于傳統(tǒng)的染色體畸變率分析和淋巴細(xì)胞微核分析，Pig-a 基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)時(shí)間大大縮短，從采樣到RNA提取再到RTqPCR只需花費(fèi)約2 h。

Gadd45α 基因是生長(zhǎng)抑制DNA 損傷基因45 家族成員之一，為生長(zhǎng)阻滯和DNA 損傷基因。該基因可被多種電離輻射誘導(dǎo)，以p53依賴和非依賴的方式表達(dá)增強(qiáng)，參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和DNA 的損傷誘導(dǎo)，在輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯及DNA修復(fù)中起重要作用［14］。使用Cs γ射線照射大鼠外周血，Gadd45α基因表達(dá)量與照射劑量有關(guān)，基因表達(dá)量隨照射劑量的增加具有一定的上升趨勢(shì)［15］。潘艷等［16］在實(shí)驗(yàn)中使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)60Co γ射線照射后正常人外周血永生化淋巴細(xì)胞系，結(jié)果表明：Gadd45 基因的表達(dá)水平隨照射劑量的增高而增加。本次研究中驗(yàn)證了Gadd45α基因的輻射敏感性，Gadd45α基因在健康人群中的表達(dá)量相對(duì)均一，波動(dòng)范圍較小，個(gè)體間變異??；輻射接觸人群的Gadd45α 基因表達(dá)量高于健康人群，具有較高的靈敏度，同時(shí)顯示小劑量長(zhǎng)期照射對(duì)Gadd45α 基因的表達(dá)影響是刺激基因的表達(dá)；經(jīng)X射線照射后，Gadd45α基因的表達(dá)量隨照射劑量的增加而上升，具有良好的劑量?效應(yīng)關(guān)系，與小劑量長(zhǎng)期照射后Gadd45α 基因的表達(dá)趨勢(shì)相同。以上結(jié)果均顯示出Gadd45α 基因相對(duì)表達(dá)量的變化可能作為生物劑量計(jì)。

Hprt基因位于X染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端q26.27，功能上是半合子，突變時(shí)可表現(xiàn)出來，由這個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)是一個(gè)轉(zhuǎn)移酶。該基因?qū)﹄婋x輻射以及化學(xué)誘變劑非常敏感，并且這種突變不可逆［17］。使用不同劑量的60Co γ 射線照射人肺泡細(xì)胞后，Hprt基因突變變異子數(shù)隨劑量的增加而逐漸增加，回歸方程表明兩者呈良好的線性直線關(guān)系［18］。崔鳳梅等［19］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中表明Hprt基因突變頻率與照射劑量的關(guān)系呈線性模型，隨照射劑量的增大，基因突變頻率上升。在本次研究中表明Hprt 基因的輻射敏感性，Hprt 基因在健康人群中的表達(dá)量個(gè)體間變異較大；輻射接觸人群的Hprt 基因表達(dá)量低于健康人群，具有較高的靈敏度，同時(shí)顯示小劑量長(zhǎng)期照射對(duì)Gadd45α 基因的表達(dá)影響是抑制基因的表達(dá)；經(jīng)X 射線照射后，發(fā)現(xiàn)Hprt 基因的表達(dá)量在0～2 Gy 隨照射劑量的增加而上升，具有良好的劑量?效應(yīng)關(guān)系，但在5 Gy劑量點(diǎn)表達(dá)量下降，偏離劑量?效應(yīng)曲線，與小劑量長(zhǎng)期照射后Hprt 基因的表達(dá)趨勢(shì)不同。以上結(jié)果顯示出Hprt基因相對(duì)表達(dá)量的變化是否能作為生物劑量計(jì)體系有待進(jìn)一步研究。

Pig-a基因與Gadd45α基因均具有本底值較低，差異較小，個(gè)體間變異小，對(duì)電離輻射有較高的靈敏度，基因表達(dá)量與照射劑量在大劑量與小劑量照射累積均具有良好的劑量?效應(yīng)關(guān)系等優(yōu)點(diǎn)，說明Pig-a 基因與Gadd45α 基因有發(fā)展為良好的生

物劑量計(jì)的潛質(zhì)。但Gadd45α 基因表達(dá)量在小劑量范圍內(nèi)存在波動(dòng)，人群本底值大于Pig-a 基因，波動(dòng)范圍較Pig-a基因大，所以Pig-a基因可能更具有作為良好生物劑量計(jì)的潛質(zhì)。本研究目前樣本量偏少，結(jié)果可能存在一些不確定性，下一步對(duì)Piga基因表達(dá)和輻射之間的關(guān)系做進(jìn)一步研究時(shí)，將擴(kuò)大樣本量，并增加照射后的采樣時(shí)間點(diǎn)。而Hprt 基因本底值雖然較低但個(gè)體間變異較大，并且在5 Gy 劑量點(diǎn)偏離0～2 Gy 的劑量?效應(yīng)曲線，故其是否能成為一個(gè)生物劑量計(jì)還有待研究。