馬永珍，王 芳,2,3,4,5，王 艦,2,3,4,5

（1青海大學(xué)，西寧 810016；2青海省農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016；3青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；4青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；5青海省馬鈴薯育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

0 引言

光是植物生長過程中的主要能量來源，同時(shí)光又是一個(gè)非常重要且十分復(fù)雜的環(huán)境因素。光照強(qiáng)度、光質(zhì)及光周期都對植物的生長發(fā)育有著一定的影響[1]。在組織培養(yǎng)中，光照對培養(yǎng)材料的增殖和器官分化有重要影響。尤其對外植體細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響，另外，光強(qiáng)對培育壯苗也有許多益處[2]。馬鈴薯(Solanlum tuberosumL.)是茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)雙子葉多年生草本植物，是繼水稻、小麥、玉米第四大世界糧食作物，也可作為蔬菜，同時(shí)，馬鈴薯還是加工業(yè)、化工原料和動(dòng)物飼料的重要原料[3-4]。馬鈴薯喜光、喜冷涼性環(huán)境，對光周期和溫度反應(yīng)的敏感性是其影響資源引進(jìn)是否成功的重要環(huán)境因子[5]。但目前由于馬鈴薯組培苗連續(xù)多代培養(yǎng)造成的種性退化、徒長、玻璃化和移栽成活率低制約了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，光照作為培養(yǎng)脫毒馬鈴薯組培苗的外部因素之一，直接影響培養(yǎng)材料的增殖、分化和生長。因此，開展光周期對馬鈴薯組培苗生長的影響具有一定的實(shí)際意義。

近年來，許多學(xué)者對于光周期對馬鈴薯生長的影響已經(jīng)有一定的研究。張小川等[6]以青薯9 號(hào)馬鈴薯脫毒苗為材料，研究了不同光周期對馬鈴薯試管薯形成的影響。結(jié)果表明10 h/d的光照周期試管薯結(jié)薯效果最好，單瓶結(jié)薯率達(dá)到92%。龍維彪等[7]以米拉馬鈴薯為脫毒試管苗為試驗(yàn)材料，研究了不同光照對馬鈴薯試管薯形成的影響。結(jié)果表明全黑暗條件有利于促進(jìn)米拉試管薯的形成，試管苗的結(jié)薯率、平均單薯重和每瓶結(jié)薯個(gè)數(shù)均較高；在光照強(qiáng)度為2000～2500 Lx時(shí)，4 h/d 的光照時(shí)間對試管薯誘導(dǎo)形成的效果最好。李秋琛[8]以弗烏瑞它馬鈴薯脫毒苗為材料，研究了光周期對微型薯生長發(fā)育的影響，表明在光照16 h黑暗8 h 處理下產(chǎn)量最高，薯塊大，平均單薯重最重。劉夢蕓等[9]以‘晉薯2 號(hào)’馬鈴薯原種為材料研究了光周期對馬鈴薯塊莖的影響，結(jié)果表明，短日照處理可以促使塊莖提早形成，但會(huì)使結(jié)薯率降低，植株莖葉生長受抑，塊莖淀粉含量降低。

前人對馬鈴薯光周期方面的研究大多集中在馬鈴薯試管薯，微型薯以及塊莖方面的研究[10-11]，而對于馬鈴薯組培苗的影響報(bào)道較少。因此，本研究以‘國外2號(hào)’、‘閩薯1號(hào)’以及‘青薯9號(hào)’馬鈴薯組培苗為試驗(yàn)材料，設(shè)置了3種不同的光照處理，研究探討了不同光周期處理對不同馬鈴薯品種生長和生理特性的影響，以期為不同馬鈴薯品種組培苗篩選出最優(yōu)的光照處理。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器設(shè)備MGC-300A 型智能光照培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)(Bio-Rad)、恒溫水浴鍋(THZ-82)、新世紀(jì)T6 紫外可見風(fēng)光光度計(jì)、電子精密天平PL203、電子天平ARB230、豐量牌電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(GB/1214)、直尺(20 cm)、移液槍(EPPendorf)、比色皿(0.5 cm、1 cm)、13 mL試管、計(jì)時(shí)器、1.5 mL離心管、純水器(EPED)、漩渦混合器XW-80A、-80℃超低溫冰箱(FORMA 900 SERIES)、SPEX Geno/Grinder2010 高通量動(dòng)植物組織研磨機(jī)。

1.1.2 試劑 植物可溶性蛋白(SP)定量測定試劑盒(A045-2)、過氧化氫酶(CAT)測試盒(A007-1)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(A001-1)、丙二醛(MDA)測試盒(A003-1)和脯氨酸(Pro)測試盒(A107-1-1)購自南京建成，濃硫酸由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料培養(yǎng)35 天的‘國外2 號(hào)’、‘閩薯1 號(hào)’和‘青薯9 號(hào)’組培苗為材料，由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。除頂，剪取2～3 cm 帶葉莖段，接種MS 培養(yǎng)基(pH 6.0)，置于光照時(shí)長為8 h/d、12 h/d 和16 h/d 條件下；光照強(qiáng)度4950 Lx，溫度晝夜18℃和16℃，濕度保持75%左右，每瓶接種5 株，每個(gè)處理接種42瓶，處理35天取樣，3次重復(fù)，葉片混裝在1.5 mL離心管中用于測定不同處理下的生理生化指標(biāo)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 指標(biāo)測定 表型性狀測定。鮮重、株高、莖粗、莖節(jié)數(shù)、葉片數(shù)、總根長和根數(shù)直接觀察測量。

植株干鮮重測定。將試管苗用無菌水清洗，吸去表面的水分，稱量鮮重；然后將植株放入錫箔紙中于105℃殺青40 min，85℃烘直至恒重，稱量干重[5]。

生理生化指標(biāo)測定。植物可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法、過氧化氫酶測定采用可見光法、超氧化物歧化酶測定采用羥胺法、脯氨酸測定采用酸性茚三酮法，丙二醛測定采用TBA 法[12]；所有表型性狀和生理生化指標(biāo)均3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理與方差分析均采用均Excel 2007和DPS 9.50軟件進(jìn)行處理。根據(jù)灰色系統(tǒng)要求，3個(gè)光照處理的8 個(gè)生長表型性狀指標(biāo)組成一個(gè)灰色系統(tǒng)，每個(gè)品種的每一個(gè)光照處理作為系統(tǒng)中的一個(gè)因素。比較數(shù)列記為Xi(i=1、2、3、…、8)、Xi={Xi(1)、Xi(2)、…、Xi(8)}={鮮重、干重、株高、莖節(jié)數(shù)、莖粗、根長、根數(shù)、葉片數(shù)}構(gòu)成的數(shù)列作為比較數(shù)列，選取各項(xiàng)指標(biāo)的最優(yōu)值記為參考列X0={X0(1)、X0(2)、…、X0(8)}。參照楊光華等[13]的方法計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù)、等權(quán)關(guān)聯(lián)度和加權(quán)關(guān)聯(lián)度。

首先采用極差法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理，根據(jù)公式分別求出各自的絕對離差、關(guān)聯(lián)系數(shù)、等權(quán)關(guān)聯(lián)度，采用灰色系統(tǒng)關(guān)聯(lián)度理論的權(quán)重決策法，參考判斷矩陣法給各指標(biāo)賦權(quán)重，進(jìn)而計(jì)算加權(quán)關(guān)聯(lián)度。

絕對離差的計(jì)算見公式(1)。

關(guān)聯(lián)系數(shù)的計(jì)算見公式(2)。

式中：min min|X0(k)-Xi(k) |為二級(jí)最小差，max max|X0(k)-Xi(k) |為二級(jí)最大差，ρ為分辨系數(shù)，其取值范圍在(0，1］為提高其關(guān)聯(lián)系數(shù)間的差異顯著性，此處取值0.5，認(rèn)為同等重要。

權(quán)重系數(shù)的計(jì)算見公式(3)。

等權(quán)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算見公式(4)。

加權(quán)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算見公式(5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光周期處理對馬鈴薯組培苗生長的影響

2.1.1 不同光周期處理對‘國外2 號(hào)’組培苗生長的影響 不同光周期對‘國外2號(hào)’馬鈴薯組培苗的鮮重、株高、莖節(jié)數(shù)、莖粗、根長、根數(shù)及葉片數(shù)影響如表1 所示。從表1 中可以看出，馬鈴薯組培苗的鮮重、干重、莖粗以及根長均隨著光照時(shí)間的延長呈現(xiàn)增加的趨勢，在16 h/d光照處理下鮮重、干重和根長分別為0.25 g、0.01 g 和9.33 cm，均顯著高于8 h/d (P＜0.05)。在8 h/d光照處理下株高最高為5.60 cm，顯著高于12 h/d和16 h/d(P＜0.05)。在12 h/d光照處理下根數(shù)最多為7 根，顯著高于8 h/d (P＜0.05)。此外，不同光周期處理對莖節(jié)數(shù)、莖粗以及葉片數(shù)的影響不顯著(P＞0.05)，但隨著光照時(shí)間的延長16 h/d 光照處理下莖粗達(dá)到最大，相對于8h/d增加了23.42%。

2.1.2 不同光周期處理對‘閩薯1 號(hào)’組培苗生長的影響 不同光周期對‘閩薯1號(hào)’馬鈴薯組培苗的鮮重、株高、莖節(jié)數(shù)、莖粗、根長、根數(shù)及葉片數(shù)影響如表2 所示。從表2 中可以看出，馬鈴薯的鮮重和干重隨著光照時(shí)間的延長，在16 h/d光照處理下顯著高于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。株高在12 h/d 光照處理下顯著降低(P＜0.05)，分別比16 h/d 和8 h/d 降低了44.80%和52.95%。莖節(jié)數(shù)在16 h/d光照處理達(dá)到最大為8個(gè)，顯著高于12 h/d(P＜0.05)。莖粗隨著光照時(shí)間的延長而增加，但不同處理之間差異不顯著(P＞0.05)。根長和根數(shù)也隨著光照時(shí)間的延長而有所增加，在16 h/d光照處理下達(dá)到最大，顯著高于8 h/d(P＜0.05)。葉片數(shù)在16 h/d光照處理下顯著高于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。

2.1.3 不同光周期處理對‘青薯9 號(hào)’組培苗生長特性的影響 不同光周期對‘青薯9 號(hào)’馬鈴薯組培苗的鮮重、株高、莖節(jié)數(shù)、莖粗、根長、根數(shù)及葉片數(shù)影響如表3所示。從表3中可以看出，馬鈴薯的鮮重和干重隨著光照時(shí)間的延長，在16 h/d 光照處理下顯著高于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。株高和莖節(jié)數(shù)不同處理之間差異均不顯著(P＞0.05)，都在16 h/d 光照處理下達(dá)到最大為9.57 cm 和9 個(gè)。莖粗和根長隨光照時(shí)間的延長而增加，在16 h/d 光照處理下達(dá)到最大為1.80 cm 和11.53 cm，均顯著高于8 h/d(P＜0.05)。根數(shù)在12 h/d光照處理下達(dá)到最大，顯著高于8 h/d(P＜0.05)葉片數(shù)在12 h/d 光照處理下顯著高于8 h/d 和16 h/d(P＜0.05)。

表1 不同光周期對‘國外2號(hào)’馬鈴薯組培苗生長的影響

表2 不同光周期對‘閩薯1號(hào)’馬鈴薯組培苗生長的影響

表3 不同光周期對‘青薯9號(hào)’馬鈴薯組培苗生長的影響

2.2 光周期對馬鈴薯生長表型性狀影響的綜合分析

首先采用極差法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱處理（表1、表2、表3），根據(jù)公式分別求出各自的絕對離差關(guān)聯(lián)系數(shù)、等權(quán)關(guān)聯(lián)度（表5），采用灰色系統(tǒng)關(guān)聯(lián)度理論的權(quán)重決策法，參考判斷矩陣法給各指標(biāo)賦權(quán)重（表4），進(jìn)而計(jì)算加權(quán)關(guān)聯(lián)度。

通過公式采用判斷矩陣法計(jì)算出各指標(biāo)對應(yīng)的權(quán)值，賦予各性狀指標(biāo)不同權(quán)重，其各品種的生長指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)均不同，‘國外2 號(hào)’馬鈴薯下生長綜合性能各因子影響大小依次為：葉片數(shù)>鮮重>莖粗>莖節(jié)數(shù)>根數(shù)>干重>根長>株高；‘閩薯1號(hào)’馬鈴薯下生長綜合性能各因子影響大小依次為：根數(shù)>莖節(jié)數(shù)>根長>莖粗>葉片數(shù)>鮮重>株高>干重；‘青薯9號(hào)’馬鈴薯下生長綜合性能各因子影響大小依次為：葉片數(shù)>鮮重>株高>莖節(jié)數(shù)>莖粗>根長>根數(shù)>干重。從表中可以看出，隨著光照時(shí)間的延長關(guān)聯(lián)度也有所增加，‘國外2號(hào)’、‘閩薯1 號(hào)’和‘青薯9 號(hào)’均在16h/d 等權(quán)關(guān)聯(lián)度和加權(quán)關(guān)聯(lián)度都達(dá)到最大。這表明‘國外2號(hào)’、‘閩薯1號(hào)’和‘青薯9號(hào)’均在16h/d生長表型性狀達(dá)到最優(yōu)。

表4 各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)

表5 關(guān)聯(lián)度以及排序

2.3 不同光周期處理對馬鈴薯組培苗生理生化的影響

2.3.1 不同光周期處理對可溶性蛋白含量的影響 不同光照處理對各品種的可溶性蛋白含量影響如圖1 所示，從圖中可以看出，‘國外2號(hào)’的可溶性蛋白含量隨著光照時(shí)數(shù)的延長而增加，在16 h/d 光照處理下最大為107.95 gport/L，顯著大于8 h/d 和12 h/d(P＜0.05)?！}薯1號(hào)’和‘青薯9號(hào)’的可溶性蛋白含量均在8 h/d光照處理下最大為24.71 和46.57 gport/L，顯著大于12 h/d 和16 h/d(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，在16 h/d 光照處理下可以顯著促進(jìn)‘國外2號(hào)’馬鈴薯可溶性蛋白含量的積累，在8 h/d光照處理下可以顯著促進(jìn)‘閩薯1號(hào)’和‘青薯9號(hào)’馬鈴薯可溶性蛋白含量的積累。

2.3.2 不同光周期處理對過氧化氫酶的影響 不同光照處理對各品種的過氧化氫酶(CAT)活性影響如圖2 所示，從圖中可以看出，‘國外2號(hào)’和‘青薯9號(hào)’的CAT活性均隨著光照時(shí)數(shù)的延長而降低，在16 h/d 光照處理下顯著低于8 h/d 和12 h/d(P＜0.05)?！}薯1 號(hào)’的CAT 活性在12 h/d 光照處理下最大為0.80 U/mgprot，顯著大于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。

2.3.3 不同光周期處理對超氧化物歧化酶的影響 不同光照處理對各品種的超氧化物歧化酶(SOD)活性影響如圖3所示，從圖中可以看出，‘國外2號(hào)’的SOD活性在12 h/d 光照處理下顯著高于8 h/d 和16 h/d(P＜0.05)?！}薯1號(hào)’的SOD活性在8 h/d光照處理下顯著高于12 h/d和16 h/d(P＜0.05)?！嗍?號(hào)’的SOD活性在16 h/d 光照處理下顯著高于8 h/d 和12 h/d(P＜0.05)。

2.3.4 不同光周期處理對脯氨酸含量的影響 不同光照處理對各品種的脯氨酸(PRO)含量影響如圖4所示，從圖中可以看出，‘國外2 號(hào)’的PRO 含量在12 h/d 和16 h/d光照處理下顯著高于8 h/d(P＜0.05)。‘閩薯1號(hào)’的PRO 含量隨著光照時(shí)數(shù)的延長而降低，在16 h/d 光照處理下顯著低于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。‘青薯9號(hào)’的PPRO 含量隨著光照時(shí)數(shù)的延長而有所增加，在16 h/d光照處理下顯著高于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。

2.3.5 不同光周期處理對丙二醛含量的影響 不同光照處理對各品種的丙二醛(MDA)含量影響如圖5 所示，從圖中可以看出，‘國外2號(hào)’的MDA含量隨著光照時(shí)數(shù)的延長而降低，在16 h/d 光照處理下顯著低于8h/d和12 h/d(P＜0.05)?！}薯1 號(hào)’的MDA 含量在16 h/d光照處理下顯著高于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。‘青薯9號(hào)’的MDA 含量在8 h/d 光照處理下顯著高于12 h/d和16 h/d(P＜0.05)。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同光周期處理對馬鈴薯組培苗生長表型形狀的影響

光周期是植物對光環(huán)境變化所做出的響應(yīng)，它對植物的生長發(fā)育過程至關(guān)重要[14]。有研究表明延長光周期可以提高芽苗菜油葵的株高與葉面積[15]，提高黃瓜幼苗的生長速率、莖粗與根冠比[16]，增加西葫蘆幼苗子葉面積[17]，同時(shí)還能影響植物根莖伸長[18]。本研究中以馬鈴薯組培苗的鮮重、干重、株高、莖節(jié)數(shù)、根數(shù)、根長和莖粗為主要表型性狀，對研究了不同光周期對不同馬鈴薯品種表型性狀的影響，利用灰色關(guān)聯(lián)分析法對不同光照處理下不同馬鈴薯品種生長表型指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)，結(jié)果表明在16 h/d光照處理下‘國外2號(hào)’、‘閩薯1 號(hào)’和‘青薯9 號(hào)’的綜合指標(biāo)最優(yōu)，這說明16 h/d 的光照處理有利于馬鈴薯組培苗的生長。這與前人研究結(jié)果基本一致[19-21]。

3.2 不同光周期處理對馬鈴薯組培苗生理生化的影響

‘國外2號(hào)’馬鈴薯的可溶性蛋白含量隨著光照時(shí)數(shù)的延長而增加，在16 h/d光照處理下最高。’‘閩薯1號(hào)’和‘青薯9號(hào)’的可溶性蛋白含量均在8 h/d光照處理下最高。這表明16 h/d 光照處理下可以顯著促進(jìn)‘國外2號(hào)’馬鈴薯可溶性蛋白含量的積累，在8 h/d光照處理下可以顯著促進(jìn)‘閩薯1號(hào)’和‘青薯9號(hào)’馬鈴薯可溶性蛋白含量的積累。‘國外2號(hào)’的PRO 含量在12 h/d 光照處理下最高，‘閩薯1 號(hào)’的PRO 含量均在8 h/d光照處理下最高，‘青薯9號(hào)’的PRO含量在16h/d光照處理下最高。SOD、POD、CAT 是能夠清除植物細(xì)胞內(nèi)活性氧等自由基的主要保護(hù)酶。SOD 是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能夠消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。POD 和CAT 則具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。MDA是植物受到逆境脅迫時(shí)膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，它的積累會(huì)對生物機(jī)體產(chǎn)生毒害作用，它可與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，使膜結(jié)構(gòu)和功能受到破壞[22]。本研究結(jié)果得出，‘國外2號(hào)’和‘青薯9號(hào)’在不同光周期處理下，SOD 與CAT 沒有一定的規(guī)律性，這可能是由于‘國外2號(hào)’和‘青薯9號(hào)’馬鈴薯兩種氧化酶類對光周期不太敏感[21]。‘閩薯1 號(hào)’馬鈴薯的CAT 活性沒有一定的規(guī)律性，但在12 h/d 光照處理下SOD活性最高，MDA含量積累最少，這表明‘閩薯1號(hào)’在12 h/d光照處理下抗逆性最強(qiáng)。

本研究中，‘國外2號(hào)’、‘閩薯1號(hào)’以及‘青薯9號(hào)’都隨著光周期的延長綜合生長性能有所增加，在16 h/d光照處理下，3 個(gè)品種的綜合生長性能均達(dá)到最優(yōu)。該光照處理較8 h/d 和12 h/d 更有利于馬鈴薯組培苗的生長。同時(shí)，在16 h/d光照處理下可以顯著促進(jìn)‘國外2 號(hào)’馬鈴薯可溶性蛋白含量的合成，在8 h/d 光照處理下可以顯著促進(jìn)‘閩薯1號(hào)’和‘青薯9號(hào)’馬鈴薯可溶性蛋白含量的合成。‘國外2號(hào)’和‘青薯9號(hào)’在不同光周期處理下，由于‘國外2號(hào)’和‘青薯9號(hào)’馬鈴薯兩種氧化酶類對光周期不太敏感，SOD與CAT活性沒有一定的規(guī)律性?！}薯1 號(hào)’馬鈴薯的CAT 活性沒有一定的規(guī)律性，但在12 h/d 光照處理下SOD 活性最高，MDA 含量積累最少。此研究結(jié)論的得出，為進(jìn)一步研究馬鈴薯光周期敏感性奠定了基礎(chǔ)。