李熙，張古月，龍劍，李潤(rùn)成

（1.長(zhǎng)沙市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法局長(zhǎng)沙 410013;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院長(zhǎng)沙 410128）

雞毒支原體（Mycoplasma Galliscepticum，MG）是危害養(yǎng)雞業(yè)的重要病原，在雞群具有較高的感染率[1-2]，我國(guó)雞群感染陽(yáng)性率可達(dá)到50%～80%[3]。雞在4～8 周齡時(shí)對(duì)該病原最為敏感[4]。2019 年9 月，邵陽(yáng)某雞場(chǎng)一批50 日齡左右的雞，6,000 羽左右，地面飼養(yǎng)，白天室外放養(yǎng)，晚上關(guān)入雞舍。一天早晨突然發(fā)現(xiàn)死亡40 多羽，根據(jù)臨床情況懷疑MG、副禽嗜血桿菌、大腸桿菌3 種病原中的一種或幾種混合感染，采集病料樣本進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)分析，并采取針對(duì)性防控措施控制了疫情，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料

1.1 病料：雞鼻竇黏液、喉氣管及肝臟樣本。

1.2 主要試劑：DNA 提取試劑盒（柱式病毒DNAout）、PCR 酶mix3.0，購(gòu)于北京天恩澤生物科技有限公司；巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自貝瑞特生物技術(shù)(鄭州)有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 病雞的臨床、解剖觀察

首先對(duì)發(fā)病雞群進(jìn)行臨床觀察，然后取3 只臨床表現(xiàn)具有代表性的雞，按常規(guī)方法進(jìn)行解剖觀察并記錄。

2.2 細(xì)菌分離鑒定

用無(wú)菌接種環(huán)鉤取鼻竇分泌物、肝臟樣本，分別劃線接種至巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37 ℃溫箱中培養(yǎng)36 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，如有優(yōu)勢(shì)菌落生長(zhǎng)則進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)菌純培養(yǎng)鑒定。

2.3 病毒檢測(cè)

按照DNA 提取試劑盒說明書提取解剖雞鼻竇、喉氣管分泌物基因組DNA，然后用參照文獻(xiàn)[5]合成的雞毒支原體檢測(cè)引物，以提取的基因組做為模板，進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR 體系為：PCR Mix 25 μL、純水21 μL、上游引物1μL、下游引物1 μL、模板2 μL。PCR 退火溫度為50℃，PCR 完畢后進(jìn)行產(chǎn)物的電泳鑒定，并將陽(yáng)性產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2.4 防控

根據(jù)臨床觀察結(jié)果擬定初步方案進(jìn)行防控，待實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果明確后再考慮是否需要制定新的防控措施。

3 結(jié)果

3.1 臨床解剖觀察結(jié)果

臨床觀察發(fā)病雞群，有少量雞存在一側(cè)或兩側(cè)眼睛流淚或充滿干酪樣滲出物，失明（圖1、2），但未發(fā)現(xiàn)明顯甩頭和呼吸異常。擠壓死亡病雞鼻孔可見大量黏液流出（圖3），喉部有干酪樣滲出物、氣管內(nèi)充滿黏液（圖4），其它病變不明顯；單側(cè)眼睛失明但尚未死亡的病雞，發(fā)現(xiàn)除眼睛出現(xiàn)上述問題、鼻竇充滿黏液外（圖5），氣管以及其它臟器均無(wú)明顯病變。

圖1、眼睛流淚

圖2、眼睛充滿干酪樣物質(zhì)

圖3、鼻孔有黏液擠出

圖4、氣管內(nèi)布滿黏液

圖5、鼻竇充滿黏液

3.2 細(xì)菌分離鑒定

無(wú)菌操作取眼睛分泌物、鼻竇黏液劃線接種巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37℃培養(yǎng)48 小時(shí)。結(jié)果眼睛分泌物接種的培養(yǎng)基上僅長(zhǎng)出幾個(gè)大小不一的菌落，未分離到大量直徑較大、灰白色、類似于大腸桿菌的菌落；鼻竇黏液接種的培養(yǎng)基上，除長(zhǎng)出一些大小、形態(tài)不一的菌落外，無(wú)菌落形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌生長(zhǎng)，未見到小而半透明，針尖狀，類似副雞嗜血桿菌的小菌落[6]。

3.3 雞毒支原體的PCR 檢測(cè)

取鼻竇及氣管分泌物提取DNA 基因組，并以提取的基因組為模板，采用參照文獻(xiàn)[5]合成的MG 檢測(cè)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果從3 個(gè)樣本均擴(kuò)增出了預(yù)期大小的特異性條帶（圖6）。

將陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果來自3 個(gè)樣本的序列同源性為100%，將其中1 個(gè)樣本測(cè)出序列上傳至GenBank，登錄號(hào)為MN526743。該序列與Gen-Bank 登錄的其它MG 菌株相應(yīng)片段同源性見圖7。由圖可見從病料樣本中測(cè)出的MG 脂蛋白序列與2016 年提交，來自中國(guó)病雞肺臟的菌株QHDT-1（登錄號(hào)：KY088075）具有100%的同源性。

圖6、雞毒支原體PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖7、雞毒支原體同源性比較圖

3.4 防控

首先根據(jù)臨床初步診斷結(jié)果，采用對(duì)MG、副雞嗜血感染、大腸桿菌均有效的廣譜抗生素多西環(huán)素，飲水添加飼喂，同時(shí)適當(dāng)降低雞群密度，3d 后，沒有再出現(xiàn)死亡病例，也未見到眼睛失明病雞數(shù)量的增加，但眼睛已失明的雞未康復(fù)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果證明無(wú)明顯副雞嗜血桿菌和大腸桿菌感染后，再改用對(duì)支原體有特效的泰萬(wàn)菌素飼喂4d。除已出現(xiàn)眼睛失明的病雞外，沒有再發(fā)現(xiàn)雞群中出現(xiàn)類似異常情況。

4 討論與分析

本文對(duì)一規(guī)模雞場(chǎng)雞群突然出現(xiàn)死亡、少量雞只眼睛流淚、一側(cè)眼睛失明的病例進(jìn)行了臨床和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。結(jié)果從眼睛分泌物僅培養(yǎng)出幾個(gè)形態(tài)不一的菌落，表明樣本中沒有大量可生長(zhǎng)于巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂的細(xì)菌存在，說明該病例可能并非大腸桿菌引起的全眼球炎；從鼻竇黏液沒有培養(yǎng)出形態(tài)一致，數(shù)量上具有優(yōu)勢(shì)的菌落，更未發(fā)現(xiàn)類似副雞嗜血桿菌的菌落，同樣可以排除副雞嗜血桿菌引起的雞傳染性鼻炎。但從氣管分泌物均檢測(cè)到MG，可以推斷該次雞群出現(xiàn)發(fā)病應(yīng)該主要是由MG 感染引起。結(jié)合臨床使用主要針對(duì)支原體的藥物，很快控制了疫情，進(jìn)一步證明該次雞群發(fā)病的主要原因。此外，測(cè)定的脂蛋白基因序列比對(duì)結(jié)果表明，樣本中MG 與來自中國(guó)病雞肺臟，2016 年提交至GenBank 的菌株QHDT-1 具有100%的同源性，該毒株在我國(guó)雞群是否屬于一個(gè)流行較廣的毒株尚需進(jìn)一步調(diào)查。

MG 除可通過雞蛋傳播[7]外，上呼吸道和黏膜是其自然感染的通道。其主要寄生在雞的呼吸道和結(jié)膜表面，上呼吸道和結(jié)膜是氣溶膠和飛沫中菌株進(jìn)入機(jī)體的通道，免疫抑制和較差的環(huán)境條件或其他應(yīng)激因素可能有助于誘發(fā)嚴(yán)重的MG 疾病[8]。因此雞場(chǎng)做好飼養(yǎng)管理，提高雞群健康水平，并且適當(dāng)降低雞群密度，在做好防寒工作的同時(shí)，盡量減少雞舍空氣中可傷害上呼吸道黏膜的氨氣、硫化氫，以及可攜帶MG 的飛沫，對(duì)于MG 的防控具有非常重要的作用。此外，雞MG 可產(chǎn)生耐藥性[8]，有條件的雞場(chǎng)可以考慮進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，選用敏感藥物進(jìn)行防控，如果未進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)則建議選用2—3 種敏感藥物輪換使用，以防MG 的耐藥性影響疾病防控效果。