肖燕， 劉磊, 沈凱奇, 袁帥， 張含， 李文鹿

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心 (河南鄭州 450052)

肺炎是老年人最常見(jiàn)的感染性疾病之一, 嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量和壽命。而且肺炎不僅是老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)及肺癌死亡的主要誘因, 還是住院患者的主要并發(fā)癥[1]。有研究表明，中國(guó)每年有 250萬(wàn)肺炎患者, 肺炎相關(guān)疾病導(dǎo)致死亡的患者達(dá)12.5萬(wàn) (5%)[2]。雖然肺炎的發(fā)生率在中國(guó)有穩(wěn)定下降的趨勢(shì)，但是目前仍是中國(guó)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[3]。牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis，Pg)是一種革蘭陰性專性厭氧菌，是牙周組織感染最重要的致病菌[4]。其對(duì)宿主細(xì)胞造成感染的主要毒力因子包括表面的菌膜及莢膜及分泌的脂多糖及牙齦蛋白酶[5]。研究表明Pg與全身健康密切相關(guān)，其能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，加速非酒精類脂肪類肝病的發(fā)展[6]，增加消化系統(tǒng)的惡性腫瘤的患病率及病死率[7]。對(duì)于肺部感染方面，大量的流行病學(xué)證實(shí)較差的口腔衛(wèi)生條件增加了肺炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，改善口腔衛(wèi)生或局部使用抗菌藥物能夠降低肺炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。有研究表明口腔細(xì)菌與肺部菌群具有高度的同源性，表明口腔細(xì)菌可能是肺部細(xì)菌的主要來(lái)源[10]。而且Pg在吸入性肺炎的呼吸道分泌物中檢出的概率高達(dá)40%[11]。細(xì)胞的增殖與凋亡保持相對(duì)平衡對(duì)組織的正常形態(tài)和功能具有重要作用，病理?xiàng)l件下，凋亡與增殖的失衡導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)一步破壞組織細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)[12]。目前Pg感染肺上皮細(xì)胞的分子機(jī)制方面的研究少見(jiàn)，2017年9—12月本研究通過(guò)建立Pg感染肺部上皮細(xì)胞的體外模型，研究其對(duì)肺上皮細(xì)胞凋亡及增殖的影響及作用機(jī)制。進(jìn)一步探究Pg牙周感染促進(jìn)肺炎并引起肺部損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑及儀器 人支氣管上皮細(xì)胞 16HBE,人肺腺癌 SPC-A-1 細(xì)胞均購(gòu)自上海中喬新舟；牙齦卟啉單胞菌(Pg)均購(gòu)自鄭州九龍生物；TRIZOL試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；DEPC(焦碳酸二乙酯)購(gòu)自美國(guó)Amresco；TSA培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基來(lái)自青島海博；熒光定量PCR儀及48孔的PCR板(Illumina Eco)來(lái)自美國(guó)Illumina；電泳儀(DYY-6C)來(lái)自北京六一儀器廠

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌感染刺激細(xì)胞 為了便于實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用CCK-8檢測(cè)抑制細(xì)胞增活力的最小細(xì)菌裂解液濃度，結(jié)果顯示每100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基中添加的有效裂解液濃度分別是16HBE(4 μL)及SPC-A-1(8 μL)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果添加2倍有效刺激體積的細(xì)菌裂解液于100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)基中。然后處理時(shí)間分別為12、24、36、48 h。收集處理細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別進(jìn)行Caspase-3活性、白細(xì)胞介素(IL)-6/IL-8和生物分子mRNA檢測(cè)。

1.2.2 Caspase-3活性檢測(cè) 采用分光光度法原理的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。孵育條件是37℃孵育120 min，發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)測(cè)定A405。樣品的A405扣除空白對(duì)照的A405，即為樣品中Caspase-3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比從而計(jì)算出樣品中的pNA。一個(gè)酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，在37℃ 1 h內(nèi)可以剪切1 nmol Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生1 nmol pNA的Caspase-3的酶量，所以根據(jù)pNA計(jì)算出Caspase-3的活力。

1.2.3 IL-6/IL-8檢測(cè) 采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)兩種蛋白的表達(dá)水平。待測(cè)樣本孔中加入40 μL樣本、待測(cè)蛋白抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60 min。測(cè)定是在添加終止液10 min后以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)得各孔的吸光度(OD值)，計(jì)算并記錄各個(gè)樣品的吸光度OD值(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度)。

1.2.4 生物分子mRNA檢測(cè) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度及 純度，取1 μg RNA按試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GADPH為內(nèi)參，采用 SYBR Green 染料法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min， 95℃變性10 s，65℃退火20 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCT計(jì)算各生物分子mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)用的基因引物

2 結(jié)果

2.1 Caspae-3活性檢測(cè)結(jié)果 Pg裂解上清液對(duì)16HBE及SPC-A-1細(xì)胞隨著刺激時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3酶活性逐漸增強(qiáng)。而且在12 h相較于空白對(duì)照組酶活性就顯著增強(qiáng)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

項(xiàng)目16HBCSPC-A-112 h24 h36 h48 h12 h24 h36 h48 hPg1.90±0.343.00±0.483.41±0.403.57±0.511.36±0.112.51±0.153.53±0.464.16±0.34空白對(duì)照0.99±0.081.02±0.110.99±0.131.01±0.011.03±0.140.99±0.131.02±0.110.95±0.11t值4.4556.93710.1148.7773.27213.6799.22015.779P值0.0380.0020.0010.0130.0310.0000.0010.000

注：1個(gè)酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，在37℃ 1 h內(nèi)可以剪切1 nmol Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生1 nmol pNA的caspase-3的酶量

2.2 IL-6及IL-8檢測(cè)結(jié)果 隨著Pg裂解上清液刺激時(shí)間的增加，2種肺部上皮細(xì)胞的IL-6及IL-8水平逐漸提高。對(duì)2種肺上皮細(xì)胞的感染刺激實(shí)驗(yàn)中，IL-6在12 h時(shí)相對(duì)于對(duì)照組已經(jīng)有顯著性的增加；IL-8在12 h時(shí)受感染的16HBE細(xì)胞中表達(dá)已有顯著增加，24 h時(shí)2種肺上皮細(xì)胞均有顯著性增加。見(jiàn)表3。

項(xiàng)目16HBCSPC-A-112 h24 h36 h48 h12 h24 h36 h48 h空白對(duì)照0.55±0.020.64±0.030.76±0.030.91±0.020.45±0.040.59±0.020.71±0.010.84±0.01IL-61.03±0.051.38±0.041.69±0.031.82±0.011.05±0.011.39±0.021.68±0.091.99±0.02t值15.77925.59241.7392.19727.16947.65418.04893.173P值<0.000<0.000<0.000<0.000<0.000<0.000<0.01<0.000空白對(duì)照0.52±0.010.64±0.010.78±0.040.84±0.050.47±0.020.58±0.010.68±0.000.77±0.03IL-80.82±0.011.32±0.061.58±0.041.81±0.080.56±0.051.13±0.201.55±0.141.78±0.28t值42.42719.80423.47217.4362.7574.70810.8186.303P值<0.000<0.000<0.000<0.000<0.05<0.05<0.01<0.05

2.3 生物分子mRNA檢測(cè)結(jié)果 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與0 h未添加刺激物時(shí)的各基因mRNA含量比較，可以發(fā)現(xiàn)16HBE及SPC-A-1細(xì)胞在Pg裂解液感染下12 h Bax和Fas-FasL就有顯著性增加(P<0.05)，且隨著時(shí)間的增加，表達(dá)也逐漸增強(qiáng)。16HBE在36 h及48 h Bcl-2含量有顯著性下降，在48 h TGF-β有顯著性下降(P<0.05)。SPC-A-1在36 h Bcl-2含量有顯著性下降，在36 h及48 h TGF-β有顯著性下降(P<0.05)。見(jiàn)表4、5。

項(xiàng)目STAT3TGF-βBcl-2BaxSurvivnFasFasL0 h1.06±0.061.02±0.031.12±0.101.00±0.011.06±0.220.99±0.021.09±0.1212 h0.99±0.060.97±0.021.05±0.081.77±0.031.07±0.061.51±0.163.02±0.04t值1.4472.5810.914-46.759-0.179-5.696-27.204P值0.2210.0610.4130.0000.8660.0050.00024 h1.03±0.030.97±0.101.03±0.072.57±0.101.13±0.125.22±0.705.20±0.06t值0.8560.8711.196-26.125-0.977-10.433-53.928P值0.4400.4330.2980.0010.3840.0090.00036 h1.02±0.050.95±0.090.91±0.024.24±0.461.03±0.028.76±0.828..69±0.82t值0.8151.2083.692-12.1851.813-16.344-15.943P值0.4610.2940.0210.0000.1440.0040.00348 h1.10±0.110.88±0.010.91±0.046.86±0.431.11±0.079.93±1.628.97±0.59t值-0.5638.2873.492-23.655-1.02-9.557-22.748P值0.6040.0010.0250.0020.3650.0110.000

注：所有的mRNA含量均是相較于內(nèi)參基因GAPDH的相對(duì)表達(dá)量

項(xiàng)目STAT3TGF-βBcl-2BaxSurvivnFasFasL0 h1.03±0.041.03±0.041.03±0.061.08±0.081.02±0.061.09±0.090.98±0.0712 h1.10±0.120.99±0.050.99±0.051.32±0.021.00±0.052.36±0.252.35±0.06t值-1.0801.1240.986-5.1840.441-8.38-26.501P值0.3410.3240.3800.0070.6820.0010.00024 h1.08±0.111.00±0.100.99±0.052.41±0.151.06±0.064.52±0.244.91±0.27t值-0.8060.6950.963-13.655-0.816-23.095-24.705P值0.4660.5250.3900.0000.4600.0000.00036 h1.00±0.010.87±0.020.89±0.014.15±0.071.05±0.027.86±0.796.80±0.24t值0.9426.4124.424-50.424-0.803-14.765-40.998P值0.4430.0030.0430.0000.4670.0000.00048 h1.05±0.090.73±0.020.97±0.094.62±0.411.09±0.169.04±0.999.92±0.99t值-0.51212.3021.023-14.674-0.663-13.875-15.638P值0.6360.0000.3640.0000.5440.0000.004

注:所有的mRNA含量均是相較于內(nèi)參基因GAPDH的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

Pg是公認(rèn)的牙周致病菌之一，能夠隨呼吸進(jìn)入下呼吸道和肺部從而引發(fā)肺部疾病[13]。嚴(yán)格地控制口腔衛(wèi)生可明顯的降低老年人肺炎的發(fā)生率[14]。研究表明Pg能夠激活TLR2和TLR4，傳導(dǎo)炎癥信號(hào)，促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IL-6、IL-8等炎癥因子參與牙周炎的炎癥反應(yīng)過(guò)程[15]。李磊濤等[16]在Pg體外感染模型中發(fā)現(xiàn)，Pg標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC感染可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖，且促進(jìn)其凋亡。李新[17]在使用Pg刺激A549細(xì)胞株時(shí)發(fā)現(xiàn)，Pg能夠定植于呼吸道上皮細(xì)胞，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡壞死。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性。Caspase-3活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在12 h時(shí)就能明顯的促進(jìn)2種肺上皮細(xì)胞凋亡，且隨著時(shí)間的增加，促凋亡作用越大。這說(shuō)明Pg對(duì)肺部的感染損傷作用主要是通過(guò)抑制肺部細(xì)胞的增殖修復(fù)和促進(jìn)肺部感染細(xì)胞凋亡兩方面來(lái)實(shí)現(xiàn)。

IL-6及IL-8均屬于前炎癥細(xì)胞因子，能夠引發(fā)宿主免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。正常情況下，IL-6及IL-8參與機(jī)體的免疫防御，但是當(dāng)肺部感染存在時(shí)能夠過(guò)度活化并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)加重，造成肺部感染損害[18]。采用Pg-Lps刺激人牙髓細(xì)胞后，IL-6及IL-8的分泌呈時(shí)間依賴性增加[19]。在下呼吸道感染的患者血清中發(fā)現(xiàn)IL-8及IL-6 水平明顯高于正常人[20]。本研究也得出相似的結(jié)果，Pg能夠促進(jìn)感染的16HBC及SPC-A-1細(xì)胞分泌IL-6和IL-8。相較于沒(méi)有感染的對(duì)照組，12 h時(shí)IL-6及IL-8在16HBC細(xì)胞中即顯著性增加，12 h時(shí)IL-6在SPC-A-1細(xì)胞中顯著增加，24 h時(shí)IL-8在SPC-A-1細(xì)胞中顯著增加。說(shuō)明Pg導(dǎo)致肺炎，引起肺部損傷的可能途徑是炎癥誘導(dǎo)的凋亡。

細(xì)胞凋亡現(xiàn)已確認(rèn)的途徑主要有2種，外部途徑中Fas與配體FasL結(jié)合激活死亡誘導(dǎo)信號(hào)蛋白(DISC)，使得Caspase-8活化，從而激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[21]。內(nèi)部途徑中，Bax蛋白起到了決定性作用，能夠誘導(dǎo)線粒體外膜的通透性發(fā)生變化，釋放細(xì)胞色素C至胞漿中，激活Caspase-3，從而引起內(nèi)部凋亡的產(chǎn)生[22]。Survivin和 Bcl-2都是凋亡抑制因子，但是Survivin基因是作用于終末效應(yīng)子Caspase-3及Caspase-7，而Bcl-2是作用于內(nèi)源性途徑過(guò)程中的細(xì)胞色素C從線粒體的釋放過(guò)程[23]。Bcl-2蛋白家族是重要的凋亡調(diào)控蛋白，主要包括抗細(xì)胞凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子Bax。STAT3是一種促細(xì)胞增殖因子，其能夠上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2及Survivin的表達(dá)，并且抑制凋亡基因Bax的表達(dá)[24]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，Pg刺激16HBC及SPC-A-1細(xì)胞能夠促進(jìn)促凋亡因子Bax、Fas、FasL的表達(dá)及抑制增殖因子TGF-β、Bcl-2的表達(dá)，而凋亡抑制因子STAT3及Survivn卻無(wú)顯著性變化，且隨著時(shí)間的增加，促凋亡因子表達(dá)逐漸增強(qiáng)。說(shuō)明Pg導(dǎo)致肺炎，造成肺部損傷的機(jī)制是通過(guò)凋亡的內(nèi)外途徑導(dǎo)致感染細(xì)胞凋亡，并且抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl-2，但是Pg引起肺部細(xì)胞的感染作用與STAT3及Survivn可能無(wú)關(guān)。Pg能夠誘導(dǎo)CD69+淋巴細(xì)胞高表達(dá)Fas-FasL,并且用抗 Fas單克隆抗體阻滯 Fas-FasL 相互作用導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡的明顯減少,但殘余的細(xì)胞凋亡活動(dòng)與陰性對(duì)照相比仍高[25]。也就是說(shuō)除了Fas-FasL途徑誘導(dǎo)的凋亡外，Pg可能還通過(guò)其他途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括內(nèi)源性Bax途徑的凋亡。

STAT3的持續(xù)活化能夠通過(guò)上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2及Survivn使組織的生長(zhǎng)和凋亡失調(diào)[26]，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體免疫攻擊，但是本研究發(fā)現(xiàn)Pg感染的2種肺上皮細(xì)胞并沒(méi)有持續(xù)性的活化和過(guò)表達(dá)STAT3。這提示我們，Pg造成的肺部細(xì)胞的凋亡與STAT3可能無(wú)關(guān)。而且我們還發(fā)現(xiàn)，Pg對(duì)于肺上皮的感染損傷最先開始的是促凋亡因子作用，然后是促凋亡因子與抑制凋亡因子共同作用。研究表明，Pg-LPS共同培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)從48 h的16.36%增加到96 h的47.17%。并且與對(duì)照組相比, 淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)在48、72、96 h時(shí)間點(diǎn)上有顯著性的差異[27]。提示我們，隨著感染刺激時(shí)間的增加，促凋亡因子能夠反作用抑制凋亡抑制因子的表達(dá)，從而使凋亡發(fā)生，加重感染造成的肺部細(xì)胞的損傷。

綜上所述，Pg感染肺部上皮細(xì)胞，引起炎癥因子的釋放，通過(guò)抑制TGF-β及Bcl-2的表達(dá)抑制肺部上皮細(xì)胞的增殖，并且通過(guò)促進(jìn)促凋亡因子Bax及Fas-FasL的表達(dá)促進(jìn)肺部上皮細(xì)胞的凋亡，從而造成肺部上皮細(xì)胞的損傷，加重肺部的感染。也可以表明牙周致病菌促進(jìn)了肺炎的發(fā)生、發(fā)展。本研究的局限性在于應(yīng)進(jìn)一步沉默這些相關(guān)基因的表達(dá)，以進(jìn)一步驗(yàn)證Pg對(duì)肺上皮細(xì)胞感染后這些基因的表達(dá)變化。