陳冬萍， 肖建民， 董志會， 曾素芬， 張素貞

暨南大學附屬東莞醫(yī)院、東莞市濱海灣中心醫(yī)院 1中心實驗室， 2心血管內(nèi)科(廣東東莞 523900)

左旋聚乳酸(poly-L-lactic acid，PLLA)由于其較好的機械性能和生物相容性，廣泛用于臨床各個領域包括冠脈支架、骨科支架等[1]，但還存在植入部位慢性炎癥等問題，并影響臨床使用效果。其生物相容性與炎癥反應密切相關。巨噬細胞作為慢性炎癥反應中最具代表性的炎癥細胞，根據(jù)不同微環(huán)境產(chǎn)生不同功能的經(jīng)典活化(classically activated)的M1型和替換活化(alternatively activated)的M2型亞群。姜黃素是姜科植物姜黃根莖的主要成分，通過多種作用機制發(fā)揮抗炎、抗氧化等多種功能[2]調節(jié)巨噬細胞的極化。生物可降解材料在體內(nèi)降解過程中，持續(xù)的炎癥反應可相應增加移植失敗風險。因此對PLLA引起巨噬細胞M1/M2極化的研究有助了解生物可吸收材料如何影響免疫反應[3]。我們的前期研究表明，PLLA支架對豬冠脈內(nèi)皮層有一定炎癥反應，PLLA對人主動脈內(nèi)皮細胞有炎癥和功能損失的影響并且姜黃素有緩解功能[4]，但姜黃素對低分子PLLA顆粒誘導的巨噬細胞的極化的影響尚不明確。為了探討PLLA對機體的炎癥反應和姜黃素的抗炎功能，2018年7月至2020年3月,我們將通過細胞實驗，研究PLLA預降解產(chǎn)物對巨噬細胞M1亞型細胞因子和M2亞型細胞因子表達的影響，并研究姜黃素對PLLA引起的巨噬細胞極化的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 主要試劑包括有端羥基左旋聚乳酸(PLLA)(Mw 0.7萬，購自濟南岱罡生物工程有限公司，#DG-LOH030)、人單核細胞白血病單核細胞(THP-1)(中喬新舟，#ZQ0086)、細胞培養(yǎng)基(RPMI 1640)(Gibco，#11875085)、胎牛血清(Scien Cell，#0500)、青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco，#15140122)、佛波酯(PMA)(上海MCE，#HY-1879)、姜黃素(上海MCE，#HY-N0005)、CCK-8試劑盒(日本，同仁)、乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物工程研究所，#A019-2)、白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-10的酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA試劑盒，MEIMIAN公司)、總RNA提取試劑(Trizol試劑盒，上海生工，#B511311)、 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒(TaKaRa，#RR047A)、SYBR qPCR Mix試劑盒(廣州四和，#SH3005)等。主要儀器包括有：電子天平(賽多利斯，BSA223S)、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，150i)，超級潔凈臺(蘇州凈化，SW-CJ-1F)，高速冷凍離心機(EPPENDORF，5804R)，酶標儀(Thermo Scientific，MULTISKAN FC)，熒光PCR儀(上海宏石，SLAN-96P)。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料和試劑準備 (1)PLLA：在超級潔凈臺中以紫外線照射方式消毒后，5 g PLLA粉末用50 mL 1640完全培養(yǎng)基制成懸液，濃度為100 mg/mL。(2)PMA：1 mg PMA溶解于0.5 mL DMSO中，并輕輕搖勻使其溶解濃度為2 mg/mL的佛波醇酯；(3)姜黃素：10 mg姜黃素溶解于2.715 mL DMSO溶解，得到10 mmol/L濃度，再用培養(yǎng)基10倍稀釋得1 mmol/L濃度姜黃素，1 mL分裝，-80℃冰箱保存；(4)細胞培養(yǎng)基：取440 mL RPMI 1640、50 mL 56℃滅活30 min的胎牛血清、5 mL 谷氨酰胺、5 mL青霉素-鏈霉素配制成含10%胎牛血清的1640細胞培養(yǎng)基，谷氨酰胺濃度為1%，青霉素-鏈霉素的濃度為100 U/mL。

1.2.2 THP-1細胞培養(yǎng) 將THP-1細胞用滅菌的滴管輕輕吹打混勻，將細胞懸液吸到滅菌的離心管中，低速離心1 000 r/min離心5 min，去除上清液，底部細胞加入含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液輕輕吹打使細胞重懸，轉移到細胞培養(yǎng)瓶中，旋松瓶蓋，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24～48 h以1∶1傳代。

1.2.3 巨噬細胞誘導 調整THP-1單核細胞細胞密度為2×105·mL-1，加入含100 ng/mL PMA的培養(yǎng)基中，加到24孔板于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。然后棄上清，用無菌D-Hanks液洗滌3次再加入無血清RPMI 1640 540 μL，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用于下一步實驗。

1.2.4 巨噬細胞鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，確認懸浮的THP-1單核細胞已經(jīng)誘導為貼壁的巨噬細胞。

1.2.5 細胞毒性試驗 調整THP-1細胞密度為5×104·mL-1，加入在96孔板中(每孔100 μL，培養(yǎng)基含100 ng/mL PMA)，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育。48 h后換新鮮無PMA的培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，更換不同濃度的PLLA(0、10、20、30、40、50、100 mg/mL)、姜黃素(5、10、20、30、40 μmol/L)，每個濃度做5個復孔。再經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔再加入10 μL CCK8溶液。細胞培養(yǎng)箱中孵育3 h后，用酶標儀檢測450 nm下吸光度。細胞毒性試驗后獲取PLLA和姜黃素作用于巨噬細胞的最佳濃度，用于后續(xù)實驗。

1.2.6 ELISA檢測炎癥因子IL-6、TNF-α和 IL-10表達水平的檢測 實驗分為4個組(對照組、PLLA組、PLLA+姜黃素組、姜黃素組)進行，每組3個復孔。各組分別孵育24 h后，收集各組細胞上清液采用酶聯(lián)免疫法，嚴格按照說明書操作步驟檢測IL-6、TNF-α和IL-10的釋放水平。

1.2.7 RT-qPCR檢測炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-10轉錄水平的檢測 分組方法同1.2.6所述。按照試劑盒說明書步驟，進行總RNA提取、逆轉錄為cDNA和real-time PCR。引物Primer Premier 5設計，由廣州捷瑞生物公司合成。見表1。熒光定量結果采用2-ΔΔCt法進行分析。

2 結果

2.1 THP1細胞經(jīng)PMA誘導為巨噬細胞 在光學顯微鏡下可見，THP1細胞由懸浮細胞經(jīng)PMA刺激72 h后成為貼壁的巨噬細胞。見圖1。

表1 IL-6、TNF-α和IL-10的引物序列

注：A：PMA誘導前，THP-1單核細胞為懸浮生長，因不易對焦而稍模糊。細胞呈圓形，形態(tài)均勻、細胞外緣折光度強；B：經(jīng)PMA誘導后，THP-1轉化為貼壁生長的巨噬細胞，細胞呈梭型或多邊形，多偽足。黑色線段示意50 μm標尺

圖1 THP-1細胞經(jīng)PMA誘導的巨噬細胞光鏡下形態(tài)學改變

2.2 PLLA、姜黃素對巨噬細胞的毒性測驗結果 PLLA濃度在0～100 mg/mL范圍內(nèi)、姜黃素濃度在0～20 μmol/L范圍內(nèi)，細胞活力均是對照組的70%以上。其中10 mg/mL的PLLA和20 μmol/L姜黃素的細胞活性最強。見表2和圖2。

藥物濃度細胞存活率(對照組的%)PLLA10 mg92.163±5.36620 mg87.730±6.72330 mg86.842±4.03240 mg81.757±6.57550 mg82.329±4.536100 mg83.608±2.927姜黃素5 μmol/L98.363±4.231 10 μmol/L96.331±6.861 20 μmol/L100.925±5.93630 μmol/L70.078±7.498 40 μmol/L51.234±4.753

2.3 PLLA、姜黃素分別對巨噬細胞極化的影響

2.3.1 各組炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-10表達水平的ELISA檢測 根據(jù)細胞毒性結果，選用對細胞增殖影響較小、細胞活力相對較高的10 mg/mL PLLA和20 μmol/L姜黃素濃度，對誘導后的巨噬細胞進行干預實驗。巨噬細胞在培養(yǎng)24 h后，收集細胞上清液對IL-6、TNF-α和IL-10等炎癥因子進行ELISA檢測，結果顯示PLLA組分泌IL-6、TNF-α、IL-10都顯著高于對照組。而姜黃素組分泌的促炎因子IL-6、TNF-α炎癥因子都顯著低于對照組，但作為抗炎因子的IL-10顯著高于對照組(P<0.01)。見表3。

2.3.2 炎癥因子TNF-α、IL-10和 IL-6轉錄水平的檢測 同樣地，對各組炎癥因子mRNA轉錄水平進行RT-qPCR檢測。結果顯示，PLLA單獨作用時，對比正常組，TNF-α、IL-6的mRNA轉錄水平均明顯上升，IL-10基因表達水平顯著下降。姜黃素加入后，對比PLLA單獨作用可見TNF-α、IL-6的mRNA轉錄水平均明顯下降，IL-10 mRNA轉錄水平顯著上升。見表4。

注：A：10～100 mg/mL PLLA作用下，細胞活力均大于正常組的70%，其中10 mg/mL的細胞活力最高；B：5～20 μmol/L的姜黃素作用下，細胞活力均大于正常組的70%，其中20 μmol/L組細胞活力最高。30 μmol/L及40 μmol/L姜黃素組細胞活力接近或低于70%

圖2 不同濃度PLLA和姜黃素對巨噬細胞毒性檢測結果

檢測因子組別 n檢測結果IL-6對照組43.47±0.429PLLA組44.71±0.227*PLLA+姜黃素組43.30±0.222△△姜黃素組42.75±0.152*TNF-α對照組4182.25±6.014PLLA組4213.13±3.224*PLLA+姜黃素組4134.75±12.470*△△姜黃素組4114.25±6.770*IL-10對照組428.13±1.349PLLA組471.27±2.503*PLLA+姜黃素組476.06±1.923*△姜黃素組477.49±4.369*

注：*與對照組比較P<0.01；與PLLA組比較△P<0.05，△△P<0.001

檢測因子組別 n檢測結果IL-6對照組40.938±0397PLLA組45.535±1.431*PLLA+姜黃素組43.886±1.739*△姜黃素組40.704±0.089TNF-α對照組41.027±0.400PLLA組42.191±0.697*PLLA+姜黃素組41.792±0.633△姜黃素組41.348±0.334IL-10對照組41.002±0.040PLLA組40.273±0.023PLLA+姜黃素組40.604±0.209*△姜黃素組41.621±0.178*

注：*與對照組比較P<0.01；△與PLLA組比較P<0.01

3 討論

PLLA作為常用的生物可降解材料，其體內(nèi)外的生物相容性得到比較充分的認可[1]。但體內(nèi)的慢性炎癥一直是影響長期生物相容性的主要因素，未能得到充分的研究。PLLA在人體中多是高分子聚合物，降解時間2～4年，可以采用低分子PLLA模擬植入后期的中間降解產(chǎn)物。本研究采用了7 000 D的PLLA顆粒作為誘導物，分子量與報道[5]相似。巨噬細胞作為慢性炎癥反應中最具代表性的炎癥細胞，參與PLLA降解過程。M1/M2這兩個亞型的細胞表面標記和分泌細胞因子均不同，分別執(zhí)行促進炎癥和調理免疫的功能，對PLLA植入后的免疫狀態(tài)產(chǎn)生影響[6]。

THP-1是人白血病單核細胞，通過PMA作用后轉化為巨噬細胞。在體外培養(yǎng)體系中，前者呈懸浮狀態(tài)，后者呈貼壁狀態(tài)。本實驗通過顯微鏡下形態(tài)學分析，對THP-1誘導得到的巨噬細胞進行了確認。此外，通過細胞毒性實驗的篩選，我們選擇細胞活力較高(大于對照組70%)的10 mg/mL PLLA和20 μmol/L姜黃素進行后續(xù)研究。有些研究的姜黃素濃度選擇30 μmol/L[7]或50 μmol/L[8]，但作用細胞不盡相同。本研究中20 μmol/L細胞活力最高，后續(xù)研究證明該濃度姜黃素已有明顯的調節(jié)巨噬細胞極化作用。

眾多的研究證據(jù)證明，巨噬細胞在不同環(huán)境刺激下呈現(xiàn)不同的免疫狀態(tài)[9]。比如M1表型的巨噬細胞可分泌大量促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6等，發(fā)揮促炎和抗原呈遞作用，M2表型巨噬細胞主要分泌抗炎因子如IL-10、IL-13、IL-14等，進而發(fā)揮免疫調節(jié)、促進傷口愈合和組織修復的作用。這些不同作用的亞型可以發(fā)生極化[10]?？梢娋奘杉毎牟煌瑏喰偷臉O化是其發(fā)揮免疫調控作用的重要途徑，也是其參與疾病過程的關鍵環(huán)節(jié)[11-14]。因此，在本研究中，選用了TNF-α、IL-6作為M1表型巨噬細胞炎癥反應標記，IL-10作為M2表型巨噬細胞炎癥反應標記。我們發(fā)現(xiàn)PLLA處理組TNF-α、IL-6要明顯高于對照組，IL-10在細胞上清中表達水平雖然也升高，但RT-PCR結果顯示IL-10的mRNA轉錄水平下降，這表明PLLA顆粒以促進巨噬細胞的炎癥反應為主。這與臨床上觀察到PLLA降解成碎片且被大量巨噬細胞包圍，局部炎癥反應明顯的現(xiàn)象吻合。Petrosyan等[15]研究PLLA細胞外基質人工組織材料對小鼠巨噬細胞M1/M2極化的影響，結果天然細胞外基質可促使巨噬細胞項修復型M2巨噬細胞表型轉化，而PLLA外基質人工組織材料則誘導巨噬細胞向炎癥M1表型轉化，提示PLLA具有誘導炎性反應作用。

巨噬細胞極化可以被調節(jié)，這就讓改良材料工藝特點、調控巨噬細胞炎癥表型從而改善生物相容性的策略成為可能。有研究在材料上添加IgG-Fab段蛋白質，從而調節(jié)人類單核巨噬細胞為非炎癥表型M2型，達到改良生物相容性的目的[16]。Shafiq等[17]觀察到PLLA-己內(nèi)酯組織材料可誘導植入局部血管管壁大量M2表型巨噬細胞浸潤，提示改良過的PLLA材料可以通過募集內(nèi)源性細胞以促進移植局部血管再生，促進巨噬細胞向M2表型轉化，提高組織相容性。

對于PLLA炎癥以及姜黃素的調節(jié)作用，國內(nèi)外也有相關研究。國內(nèi)桂靈升等[13]通過建立巨噬細胞株的體外炎癥模型，用姜黃素及PPAR-γ的特異性抑制劑GW9662對其進行干預，觀察巨噬細胞株極化狀態(tài)的改變。結果提示姜黃素可能是通過激動PPAR-γ通路促使巨噬細胞向M2型極化，為進一步研究姜黃素的抗炎機制及治療慢性低度炎癥相關的代謝性疾病提供了一個新的思路。陳方圓等[12]觀察姜黃素對脂多糖(LPS)和IFN-γ誘導的RAW264.7巨噬細胞(M1)極化的影響及機制，采用Real-time PCR、ELISA及Western blot方法檢測IL-1β、IL-6和M2表型標志分子的表達，結果發(fā)現(xiàn)姜黃素通過活化PPARγ促進LPS和IFN-γ誘導的RAW264.7巨噬細胞(M1)向M2表型極化。宋志華等[18]探討姜黃素對LPS刺激腹腔巨噬細胞(PMs)分泌炎癥因子的影響，結果顯示一定濃度的姜黃素可以抑制LPS刺激腹腔巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-6的分泌，進而減輕炎癥反應的程度。Kong等[19]比較PLLA/無定形磷酸鈣(ACP)生物可吸收支架與單純PLLA支架在冠狀動脈中引起的炎癥反應，結果發(fā)現(xiàn)ACP的應用有助于減輕PLLA所致的炎癥反應，也有助于提高PLLA生物可吸收支架的內(nèi)皮形成和功能。國外Farajzadeh等[20]探討封裝在靶向CD44的透明質酸聚乳酸(HA-PLA)納米顆粒(NPs)中的天然物質姜黃素調節(jié)巨噬細胞由M1促炎表型向M2抗炎表型極化的作用，發(fā)現(xiàn)負載姜黃素的HA-PLA NP可以改變巨噬細胞表型進而抑制LPS/IFN-γ刺激的巨噬細胞炎癥，具有靶向CD44的HA-PLA NP的姜黃素制劑可能是治療炎性疾病的有前途的途徑。Su等[21]研究姜黃素對PLLA絲和圈作為可植入支架引起的炎癥反應的影響。采用小鼠腹腔巨噬細胞模型，研究姜黃素PLLA復合物(C-PLLA)纖維的體外抗炎作用。結果發(fā)現(xiàn)姜黃素可以減少生物可吸收PLLA纖維引起的炎癥反應，同時改善機械性能，從而提示姜黃素有益于PLLA的植入。在本研究中，姜黃素單獨作用時，IL-6和TNF-α的表達水平顯著低于空白對照組，IL-10表達高于空白對照組，這也表明姜黃素具有抗炎的作用，這與報道結果類似。姜黃素和PLLA混合組與單獨的PLLA組相比，其IL-6、TNF-α濃度明顯降低，IL-10明顯升高，這說明姜黃素在一定程度上可以緩解PLLA顆粒引起的炎癥。因此，本研究也為姜黃素作為以PLLA為材料的可降解生物工程材料表面結構改性備選藥物提供一定的實驗基礎。但本研究是體外研究，沒有進行動物體內(nèi)研究。PLLA在體內(nèi)降解情況與體外低分子量粉末不同，未能完全反映體內(nèi)情況。

綜上所述，PLLA顆粒在體外促進人THP-1源巨噬細胞向炎癥亞型M1極化，姜黃素通過調節(jié)M1向M2轉化而發(fā)揮抗炎作用。