陳潤開，付小兵，孫曉艷*

1天津醫(yī)科大學研究生院，天津 300070；2解放軍總醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新研究部創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生研究中心，北京 100853；3解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心組織修復(fù)與再生全軍重點研究實驗室，北京 100048

作為人體最重要的皮膚附屬器之一，汗腺在維持機體代謝平衡方面具有不可替代的作用。大面積燒傷、嚴重撕脫傷患者創(chuàng)面瘢痕愈合后汗腺的結(jié)構(gòu)和功能缺失，致使機體無法通過汗液蒸發(fā)進行體溫調(diào)節(jié)，嚴重影響了患者的生存質(zhì)量。研究表明，外胚層發(fā)育不全(ectodysplasin，EDA)基因是汗腺發(fā)育過程中的主要功能基因之一[1]。在胚胎發(fā)育時期，EDA通過激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)與EDA受體聯(lián)合調(diào)節(jié)汗腺的發(fā)育與成熟[2]，因此EDA可作為汗腺再生的治療性靶點進行干預(yù)。目前，第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成為細胞重編程最熱門的手段之一[3]，利用該技術(shù)可以跨譜系重編程成體細胞為另一類型的成體細胞，具有效率高、脫靶率低等優(yōu)勢。在此基礎(chǔ)上，Kearns等[4]開發(fā)了一種受強力霉素(doxycycline，Dox)調(diào)控的dCas9-effector系統(tǒng)，該系統(tǒng)由dCas9與VP16四聚體激活結(jié)構(gòu)域(VP64)融合而成，使目的基因的表達更加受控。類器官是一種高度還原原位組織生理結(jié)構(gòu)及功能的新型微器官模型，由具有干性的細胞在三維條件下自我組裝形成[5]。類器官體系克服了細胞二維培養(yǎng)模式的局限性，盡可能地還原了器官發(fā)育過程[6-8]，具有傳統(tǒng)方式無法比擬的優(yōu)勢。本研究擬利用CRISPR/dCas9系統(tǒng)靶向EDA啟動子序列，上調(diào)內(nèi)源性EDA基因的表達水平，將人永生化表皮角質(zhì)細胞重編程為汗腺樣細胞，在體外三維環(huán)境下培養(yǎng)誘導(dǎo)其發(fā)育為汗腺類器官，以促進體內(nèi)汗腺的功能性再生。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人永生化表皮細胞系(human immortalized keratinocyte，HaCaT)、293T細胞購買于國家實驗細胞資源共享服務(wù)平臺；SPF級BALB/c雌性裸鼠(20只)購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司；Dulbecco's Modified Eagle's F12培養(yǎng)基、Epilife培養(yǎng)基、HKGS購自美國Gibco公司；Real Master Mix(SYBR Green)購自日本TOYOBO公司；角蛋白18(cytokeratin，CK18)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、EDA、水通道蛋白5(aquaporin 5，AQP5)、GAPDH一抗購自美國Abcam公司，二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Matrigel購自美國康寧公司。dCas9質(zhì)粒(含neo位點)、psPAX2、pMD2.G包裝質(zhì)粒由本實驗室保存。EDA基因啟動子(正義：5'-ACCCGTTCCTGCGCGACAG-3'；反義：5'-CTGTCGCGCAGGAACGGGT-3')由本實驗室提供。單鏈向?qū)NA(sgRNA)質(zhì)粒由蘇州吉瑪基因公司負責構(gòu)建。

1.2病毒包裝與收集 293T細胞在DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將dCas9質(zhì)粒和構(gòu)建完成的sgRNA質(zhì)粒分別與慢病毒psPAX2、pMD2.G包裝質(zhì)粒按3:1:4質(zhì)量比混合，使用Lip 2000共轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48、72 h后分別收集細胞上清液，過濾，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細胞轉(zhuǎn)染與篩選 HaCaT細胞在含1% HKGS的Epilife培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HaCaT細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，待細胞融合度達40%時更換為含10 μg/ml聚凝胺的新鮮培養(yǎng)基6 ml孵育0.5 h，隨后加入6 ml含有sgRNA質(zhì)粒的病毒液繼續(xù)孵育，12 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。48 h后觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達情況，并采用熒光激活細胞分選技術(shù)篩選出GFP陽性細胞。在此基礎(chǔ)上，重復(fù)上述步驟進行dCas9質(zhì)粒包裝、轉(zhuǎn)染，400 μg/ml的G418培養(yǎng)7 d后篩選出雙陽性細胞，并命名為HaCaT-E細胞。

1.4RT-PCR、Western blotting檢測EDA表達水平 汗腺培養(yǎng)基的組成如前期研究所示[9]。將細胞分為4組：HaCaT組(HaCaT細胞使用汗腺培養(yǎng)基培養(yǎng))、HaCaT+Dox組(HaCaT細胞使用含5 μg/ml Dox的汗腺培養(yǎng)基培養(yǎng))、HaCaT-E組(HaCaT-E細胞使用汗腺培養(yǎng)基培養(yǎng))、HaCaT-E+Dox組(HaCaT-E細胞使用含5 μg/ml Dox的汗腺培養(yǎng)基培養(yǎng))。誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后收集各組細胞，Trizol裂解提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR：按照Real Master Mix 10 μl、上下游引物各1 μl、cDNA模板2 μl、ddH2O補足20 μl配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min預(yù)變性；95 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s，40個循環(huán)后進行熔鏈分析。引物序列如下(5'→3')；EDA：F-GGACGGCACCTA CTTCATCT，R-TGTAGTTGGTCTTGCCCGTC；GAPDH：F-CTGGAAGATGGTGATGGGATT，R-TGTGAAGGTCGGAGTCAACGGAT。Western blotting檢測EDA蛋白的表達：細胞經(jīng)RAPI裂解提取總蛋白；熱變性后，行SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜后浸沒于5%脫脂奶粉室溫封閉0.5 h，抗體孵育后進行檢測。一抗為EDA(兔抗，1:1000)、GAPDH(鼠抗，1:1000)。

1.5經(jīng)誘導(dǎo)后HaCaT-E的細胞免疫熒光染色 由于汗腺培養(yǎng)基及Dox均不能誘導(dǎo)HaCaT細胞，因此后續(xù)實驗均使用HaCaT-E細胞進行。HaCaT-E細胞鋪板于24孔板，HaCaT-E組細胞使用不含Dox的汗腺培養(yǎng)基培養(yǎng)，HaCaT-E+Dox組細胞使用含Dox的汗腺培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，使用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定0.5 h；PBS洗滌3次，每次5 min；0.2% TritonX-100室溫孵育10 min；PBS洗滌3次，每次5 min；5%山羊血清室溫封閉30 min，一抗CK18(鼠抗，1:500)、α-SMA(兔抗，1:200)、AQP5(兔抗，1:200)4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；二抗(1:100)室溫避光孵育2 h；PBS洗滌3次，每次5 min。DAPI復(fù)染封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6汗腺類器官的體外構(gòu)建與免疫熒光染色 Matrigel提前解凍，重懸HaCaT-E細胞并調(diào)整細胞濃度為5×106/ml，與Matrigel按1:9混合均勻后，置于預(yù)冷的24孔板中，37 ℃孵育30 min使其凝固。HaCaT-E+Dox組加入含Dox的汗腺培養(yǎng)基300 μl，HaCaT-E組加入同體積不含Dox的汗腺培養(yǎng)基，孵育培養(yǎng)7 d后，收集實驗組細胞團，4%多聚甲醛固定并進行免疫熒光染色，染色步驟、抗體同1.5。

1.7燙傷模型的建立及多細胞結(jié)構(gòu)的移植 20只裸鼠隨機均分為治療組與對照組，每組10只。小鼠腳掌常規(guī)消毒，采用金屬燙傷儀85 ℃接觸5 s造成深Ⅱ度燙傷，迅速浸沒于冰水中，觀察見掌墊發(fā)白變性為建模成功[10]。收集誘導(dǎo)7 d的汗腺類器官，按5×105個/ml重懸于含Dox的汗腺培養(yǎng)基中，采取多點注射方式將類器官混懸液(50 μl)注射到治療組小鼠燙傷創(chuàng)面皮下。對照組按相同方式注射同體積的汗腺培養(yǎng)基。24 h后重復(fù)注射一次。治療組及對照組小鼠飼喂含Dox(2 μg/kg)的維持飼料，同時按100 g/kg體重的劑量腹腔注射10 mg/ml的Dox溶 液[11]，每5天重復(fù)注射一次。

1.8碘-淀粉發(fā)汗實驗及組織免疫熒光染色 移植實驗后4周，將碘酒均勻涂抹于小鼠燙傷掌面并充分干燥。將小鼠置于鋪滿淀粉的鼠籠中，使掌墊與淀粉充分接觸，于掌墊皮下注射100 μmol/L乙酰膽堿50 μl，5 min后觀察掌墊表面淀粉顏色變化，出現(xiàn)散在的藍黑色斑點為發(fā)汗實驗陽性。發(fā)汗實驗后取鼠掌組織固定、包埋后石蠟切片。脫蠟后切片進行抗原修復(fù)，5%山羊血清室溫封閉30 min，滴加一抗CK18(1:500)、α-SMA(1:200)，4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min；熒光二抗避光室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次5 min。DAPI復(fù)染封片，熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及陽性細胞篩選 轉(zhuǎn)染sgRNA質(zhì)粒48 h后，熒光顯微鏡下觀察可見GFP陽性細胞散在表達，陽性率為51.0%±2.1%。GFP陽性細胞轉(zhuǎn)染dCas9質(zhì)粒后，在添加G418抗生素(400 μg/ml)的培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選7 d，挑取陽性克隆(47.1%±1.8%)進行擴增培養(yǎng)，獲得HaCaT-E細胞。

2.2RT-PCR、Western blotting檢測EDA的表達 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，汗腺培養(yǎng)基誘導(dǎo)7 d后，與HaCaT組比較，HaCaT-E+Dox組細胞中EDA mRNA的表達水平上調(diào)(4.62±0.19)倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而HaCaT+Dox組及HaCaT-E組的EDA表達水平未見明顯上調(diào)(P>0.05，圖1A)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，HaCaT組、HaCaT+Dox組、HaCaT-E組及HaCaT-E+Dox組的EDA蛋白表達趨勢與RT-PCR檢測結(jié)果基本一致(圖1B)。

2.3H a C aT-E 細胞的形態(tài)特征及表型鑒定 HaCaT-E細胞在不含DOX的汗腺培養(yǎng)體系中形態(tài)變化不明顯。加入5 μg/ml Dox孵育培養(yǎng)7 d后，其胞體呈長梭形改變，并出現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)樣生長趨勢(圖2)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)培養(yǎng)后HaCaT-E細胞表達汗腺表面標記物CK18、AQP5、α-SMA為陽性(圖3)。

圖1 經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后4組細胞中EDA mRNA(A)及蛋白(B)表達水平比較Fig.1 Expression levels of EDA mRNA(A) and protein (B) in HaCaT-E cells after induction culture

圖2 HaCaT-E組(A)及HaCaT-E+Dox組(B)細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后的形態(tài)對比(倒置顯微鏡)Fig.2 Comparison of morphological changes between the HaCaT-E (A) and HaCaT-E+Dox group (B) after 7 days induction culture (Inverted microscope)

2.4汗腺類器官的結(jié)構(gòu)特征及表型鑒定 將HaCaT-E與Matrigel混合，采用含Dox的汗腺培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，細胞增殖、發(fā)育形成多細胞團狀球體結(jié)構(gòu)，鏡下可見其體積增大，具有中空囊腔樣結(jié)構(gòu)。而HaCaT-E組由于培養(yǎng)體系中不含Dox，無法啟動內(nèi)源性EDA基因的表達，因此誘導(dǎo)培養(yǎng)至第4天時，細胞團表現(xiàn)出增殖遲滯，形態(tài)崩解，不能長期維持多細胞的球體結(jié)構(gòu)(圖4)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，HaCaT-E+Dox組中多細胞球體結(jié)構(gòu)表達汗腺標記物CK18、α-SMA、AQP5(圖5)。

2.5汗腺類器官促進體內(nèi)汗腺的功能性修復(fù) 給予乙酰膽堿刺激后，治療組與對照組小鼠腳掌的發(fā)汗情況有明顯差異。大體觀察可見治療組小鼠掌墊表面有少量散在分布的藍黑色斑點，為發(fā)汗實驗陽性表現(xiàn)；對照組掌墊均為陰性表現(xiàn)(圖6)。發(fā)汗實驗陽性掌墊組織切片免疫熒光染色結(jié)果顯示，其表皮增厚，層數(shù)增多，基底層及亞基底層分布著大量表達GFP的工程化細胞，真皮深層及皮下組織內(nèi)散在分布著管腺樣結(jié)構(gòu)，同時表達GFP及汗腺標志性蛋白CK18及α-SMA；對照組則無上述改變， 且表皮基底層光滑，呈現(xiàn)典型的燙傷后愈合形態(tài)(圖7)。

圖3 HaCaT-E組(A)與HaCaT-E+Dox組(B)誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后汗腺表面標志物對比Fig.3 Comparison of sweat gland-associated proteins in HaCaT-E (A) and HaCaT-E+Dox group (B) after 7 days induction culture

圖4 HaCaT-E組(A)及 HaCaT-E+Dox組(B)汗腺類器官形態(tài)特點(倒置顯微鏡)Fig.4 Morphological characteristics of sweat gland organoids in HaCaT-E (A) and HaCaT-E+Dox group (B) (Inverted microscope)

圖5 CK18(A)、α-SMA(B)、AQP5(C)在汗腺類器官中的表達Fig.5 Expressions of CK18 (A), α-SMA (B), AQP5 (C) in sweat gland organoids

圖6 對照組(A)及治療組(B)裸鼠掌墊移植汗腺類器官4周后碘-淀粉發(fā)汗實驗大體觀察結(jié)果Fig.6 General observation of sweating test 4 weeks after transplantation with sweat gland organoids in nude mice of control group (A) and treatment group (B)

圖7 對照組(A)及治療組(B)碘-淀粉發(fā)汗實驗陽性腳掌組織的免疫熒光染色結(jié)果Fig.7 IF staining of sweat gland-related markers in nude mice of control group (A) and treatment group (B) engrafted with sweat gland organoids

3 討 論

大面積燒傷及嚴重創(chuàng)傷患者由于創(chuàng)面瘢痕愈合導(dǎo)致汗腺結(jié)構(gòu)損毀或?qū)Ч芏氯?，從而喪失了泌汗功能，嚴重影響了患者的生存質(zhì)量，給患者的生理和心理帶來了巨大的創(chuàng)傷。目前，汗腺的功能性修復(fù)是再生醫(yī)學研究的熱點及難點。在前期工作中，本課題組將骨髓間充質(zhì)干細胞與汗腺細胞共培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)其定向分化為汗腺樣細胞[9]。人體移植實驗表明，這些誘導(dǎo)而來的汗腺樣細胞不但可以促進創(chuàng)面內(nèi)汗腺的結(jié)構(gòu)修復(fù)，再生的汗腺還具備排汗功能。此外，Sun等[12]采用CRISPR/dCas9技術(shù)上調(diào)EDA在骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)的表達，在體外重編程其為汗腺樣細胞，重編程而來的汗腺細胞在獲得汗腺表型的同時，還能在體內(nèi)促進小鼠創(chuàng)面的功能性修復(fù)。

汗腺再生是一個復(fù)雜的生物學過程，由多種細胞、多種因子及細胞外基質(zhì)組分共同參與。然而種子細胞獲取困難，且缺乏允許汗腺生存的微環(huán)境是研究者面臨的重要挑戰(zhàn)。為解決這一難題，研究者開始探索新的治療策略，如采用生長因子、基因治療、干細胞移植及智能生物材料等。類器官是當前生物醫(yī)藥及組織工程研究的前沿領(lǐng)域。相較于采用干細胞移植促進皮膚附屬器再生的傳統(tǒng)方法，類器官技術(shù)在構(gòu)建汗腺原基初級形態(tài)及基本功能的基礎(chǔ)上，更加準確地模擬了胚胎時期汗腺的起始、延伸、發(fā)育及成熟過程。如Klaka等[13]采用懸滴培養(yǎng)法在體外構(gòu)建類汗腺三維立體模型，高度模擬了汗液分泌的生理學過程；Liu等[14]借助3D打印仿生技術(shù)構(gòu)建具有自組裝功能的類汗腺組織，模擬汗腺的自然發(fā)育進程；Diao等[15]將分離獲得的汗腺細胞與Matrigel進行混合培養(yǎng)，構(gòu)建汗腺類器官，并成功實現(xiàn)了體內(nèi)汗腺的修復(fù)與再生。但是此類方法均為采用汗腺組織細胞來構(gòu)筑類器官，而大面積燒創(chuàng)傷患者的汗腺細胞獲取困難，移植后不易存活，不利于開展大規(guī)模的臨床應(yīng)用。相比之下，表皮細胞來源廣泛，容易獲得，且與汗腺同屬外胚層來源。因此，利用表皮細胞再生汗腺大大降低了跨譜系的難度，同時解決了種子細胞獲取困難的問題。本研究以HaCaT細胞作為種子修復(fù)細胞，采用CRISPR/dCas9技術(shù)上調(diào)內(nèi)源性EDA的表達，誘導(dǎo)其跨譜系重編程為汗腺樣細胞，隨后采用Matrigel作為主體支架與重編程而來的汗腺樣細胞進行混合培養(yǎng)，在體外構(gòu)建汗腺類器官。該汗腺類器官構(gòu)建技術(shù)克服了傳統(tǒng)二維平面培養(yǎng)的局限性，最大程度模擬了體內(nèi)三維空間環(huán)境中細胞-細胞間、細胞-細胞外基質(zhì)間的相互作用，為在三維立體空間內(nèi)模擬汗腺的生理微環(huán)境，研究汗腺的發(fā)育、再生、疾病建模提供了基礎(chǔ)。

此外，本研究在移植實驗中發(fā)現(xiàn)，GFP陽性細胞在表皮層及其下方的真皮、皮下組織內(nèi)均有分布。真皮及皮下組織內(nèi)分布的GFP陽性細胞形成管腺狀結(jié)構(gòu)，并且表達汗腺相關(guān)蛋白(如CK18、α-SMA等)，表明汗腺類器官不但參與了創(chuàng)面的再上皮化，還能促進汗腺組織學結(jié)構(gòu)的修復(fù)與再生。同時碘-淀粉實驗結(jié)果進一步提示，汗腺類器官移植能夠促進創(chuàng)面的功能性修復(fù)，再生的汗腺具有發(fā)汗功能。因此，利用譜系重編程結(jié)合類器官三維培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建工程化的汗腺類器官具有可行性，為實現(xiàn)汗腺再生、解決皮膚的功能性修復(fù)問題提供了新的思路。

本研究雖然實現(xiàn)了裸鼠體內(nèi)汗腺再生，但該體系能否穩(wěn)定地保持遺傳學特性，汗腺功能能否長期高標準的維持仍需進一步研究。此外，進一步優(yōu)化體外培養(yǎng)環(huán)境，使用組織工程皮膚等仿生程度更高的生物材料替代Matrigel進行汗腺類器官培養(yǎng)，是今后值得探討的問題。