馬 會(huì)，高 梅，李 雪，張文濤，朱立欣

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

還原型谷胱甘肽是人類細(xì)胞能自然合成的一種三肽，由谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸組成，含豐富的巰基，可激活多種酶，促進(jìn)糖、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝，影響細(xì)胞整個(gè)代謝過(guò)程[1]。注射用還原型谷胱甘肽鈉主要通過(guò)巰基與體內(nèi)的自由基結(jié)合，將其轉(zhuǎn)化為容易代謝的酸類物質(zhì)從而加速排泄，臨床主要用于治療肝臟疾病、放射治療患者、化療患者、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺疾病及中毒等癥狀[2-5]。在臨床使用過(guò)程中，還原型谷胱甘肽可能會(huì)作為抗原，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，常見癥狀包括皮疹、惡心、嘔吐、血壓下降、脈搏異常等[6]。

根據(jù)《藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[7]要求，局部給藥發(fā)揮全身作用的注射劑需考察Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)，考察方法包括主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)（ASA）和被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)（PCA）。本研究按照指導(dǎo)原則的要求對(duì)注射用還原型谷胱甘肽鈉進(jìn)行了豚鼠ASA試驗(yàn)和大鼠PCA試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)情況。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UW2200H電子天平（日本島津）；JW-1032離心機(jī)（安徽嘉文）；CO2麻醉箱（北京美綠洲）；HFsafe-1200生物安全柜（上海力申）；AY220電子天平（日本島津公司）。

1.2 試劑

注射用還原型谷胱甘肽鈉（批號(hào)180401，由山東省藥學(xué)科學(xué)院提供）；牛血清白蛋白（批號(hào)829L054，Solarbio）；0.9 %氯化鈉注射液（批號(hào)3218052304，青州堯王制藥有限公司）；弗氏完全佐劑（批號(hào)SLBR3877V，Sigma）；伊文思藍(lán)（批號(hào)161222，上海藍(lán)季）；戊巴比妥鈉（批號(hào)M20180705152530，Merck）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Hartley豚鼠，由青島康大生物科技有限公司提供，體重300～400 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（魯）2016 0002；SPF級(jí)SD大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，體重150～250 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)飼養(yǎng)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2018 0031，飼養(yǎng)室溫度20～26 ℃，濕度40 %～70 %，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。

2 方法[7]

2.1 豚鼠ASA試驗(yàn)

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選取24只健康Hartley豚鼠，隨機(jī)分為4組，分別為陰性對(duì)照組、注射用還原型谷胱甘肽鈉低、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組6只，雌雄各半。

2.1.2 致敏與激發(fā) 陰性對(duì)照組給予0.9 %氯化鈉注射液，低劑量組和高劑量組分別給予注射用谷胱甘肽鈉（180，360 mg/ml），陽(yáng)性對(duì)照組給予牛血清白蛋白（20 mg/ml），致敏途徑為腹腔注射，給藥體積為0.5 ml/只，隔日1次，共致敏3次，于末次致敏后第14天分別取3只動(dòng)物（2雌1雄）快速靜脈注射激發(fā)，第21天取剩余3只動(dòng)物激發(fā)。激發(fā)時(shí)足跖靜脈注射2倍致敏劑量的抗原。

2.1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 激發(fā)給藥后即刻至3 h詳細(xì)觀察并記錄每只豚鼠的反應(yīng)，按照表1判斷過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生程度，計(jì)算過(guò)敏反應(yīng)率（每組發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)/該組動(dòng)物總數(shù)），根據(jù)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生程度綜合評(píng)價(jià)過(guò)敏反應(yīng)情況。

表1 全身過(guò)敏反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.2 大鼠PCA試驗(yàn)

2.2.1 抗體血清制備 選取16只健康SD大鼠，隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、注射用還原型谷胱甘肽鈉低、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組4只，雌雄各半。陰性對(duì)照組給予0.9 %氯化鈉注射液，低劑量組和高劑量組分別給予注射用還原型谷胱甘肽鈉溶液（100，200 mg/ml），陽(yáng)性對(duì)照組給予牛血清白蛋白（20 mg/ml）。致敏時(shí)，各組均皮下注射相應(yīng)抗原與弗氏完全佐劑等體積混合液1 ml，隔日1次，共致敏3次。末次致敏后第10天，采用戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物后腹主動(dòng)脈取血，2000 r/min離心10 min，分離抗體血清。

2.2.2 大鼠同種PCA試驗(yàn) 另取24只健康SD大鼠，按抗體血清制備階段的組別隨機(jī)分組，每組6只，雌雄各半。將動(dòng)物背部脫毛，距離中線兩側(cè)1.5 cm處選擇4個(gè)注射點(diǎn)，分別皮內(nèi)注射不同稀釋度（原液，1:2，1:4，1:8）的抗體血清0.1 ml，24 h后尾靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原與等體積的0.5 %伊文思藍(lán)混合液1 ml，激發(fā)給藥后約30 min測(cè)量皮膚內(nèi)側(cè)的藍(lán)斑直徑，大于5 mm時(shí)為陽(yáng)性。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 豚鼠ASA試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 一般狀態(tài)觀察 致敏期間，陰性對(duì)照組、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物未見異常。高劑量組動(dòng)物在首次、第二次致敏后未見異常，末次致敏后即刻出現(xiàn)不安寧、跳躍癥狀，約2 min恢復(fù)正常。

3.1.2 體重 激發(fā)時(shí)，注射用還原型谷胱甘肽鈉高劑量組豚鼠體重明顯低于同期陰性對(duì)照組（P＜0.05），其余各組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

3.1.3 過(guò)敏評(píng)價(jià)結(jié)果 激發(fā)給藥后3 h內(nèi)觀察，陰性對(duì)照組、注射用還原型谷胱甘肽鈉低、高劑量組均未見過(guò)敏反應(yīng)癥狀，過(guò)敏反應(yīng)陰性。陽(yáng)性對(duì)照組均出現(xiàn)搔鼻、步態(tài)不穩(wěn)、呼吸困難、排尿、死亡等全身過(guò)敏反應(yīng)癥狀，過(guò)敏反應(yīng)為強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性發(fā)生率100 %。結(jié)果見表3。

3.2 大鼠PCA試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 一般狀態(tài)觀察 致敏期間觀察，注射用還原型谷胱甘肽鈉低、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組所有動(dòng)物一般狀況良好，自主活動(dòng)正常，體重增長(zhǎng)正常，未見其他異常反應(yīng)。

3.2.2 體重 注射用還原型谷胱甘肽鈉低、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物體重與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表4。

3.2.3 過(guò)敏評(píng)價(jià)結(jié)果 陰性對(duì)照組、注射用還原型谷胱甘肽鈉低、高劑量組動(dòng)物注射部位各稀釋度下均未出現(xiàn)藍(lán)斑，過(guò)敏反應(yīng)陰性。陽(yáng)性對(duì)照組6只動(dòng)物均出現(xiàn)藍(lán)斑，抗體血清原液和1:2，1:4，1:8抗體血清的藍(lán)斑平均直徑大于5 mm，陽(yáng)性反應(yīng)率100 %。結(jié)果見表5。

表2 注射用還原型谷胱甘肽鈉對(duì)豚鼠體重的影響（ ±s，n=6）

表2 注射用還原型谷胱甘肽鈉對(duì)豚鼠體重的影響（ ±s，n=6）

注：*P＜0.05 vs 陰性對(duì)照組；a動(dòng)物數(shù)為3只

體重/g首次致敏 末次致敏 首次激發(fā) 末次激發(fā)a陰性對(duì)照組 / 380.33±35.12 439.91±41.73 552.12±49.94 635.71±43.65低劑量組 90 381.02±20.26 441.80±19.67 547.77±35.09 594.92±7.00高劑量組 180 387.79±16.11 406.87±24.21 441.90±50.15* 438.39±91.32*陽(yáng)性對(duì)照組 10 390.94±14.25 437.67±26.74 540.91±22.90 571.74±27.19組別 劑量/mg·只-1

表3 全身過(guò)敏試驗(yàn)觀察結(jié)果（n=6）

表4 注射用還原型谷胱甘肽鈉對(duì)大鼠體重的影響（ ±s）

表4 注射用還原型谷胱甘肽鈉對(duì)大鼠體重的影響（ ±s）

注：a動(dòng)物數(shù)為4只，b動(dòng)物數(shù)為6只

測(cè)量時(shí)間首次致敏a 末次致敏a 抗血清制備a 被動(dòng)激發(fā)b陰性對(duì)照組 / 163.42±9.48 191.07±13.25 251.95±37.91 254.05±66.50低劑量組 50 161.51±7.32 181.92±13.99 238.66±42.85 254.63±58.08高劑量組 100 161.43±8.83 185.04±18.88 253.77±51.03 255.10 ±54.70陽(yáng)性對(duì)照組 10 160.99±9.56 185.09±18.26 254.94±42.61 247.64 ±61.36組別 劑量/mg·只-1

表5 過(guò)敏性評(píng)價(jià)結(jié)果

4 討論

過(guò)敏反應(yīng)根據(jù)作用機(jī)制分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4類，其中Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)是最常見、研究最多的一類，臨床表現(xiàn)為過(guò)敏性休克、胃腸道及皮膚過(guò)敏反應(yīng)等[8]。Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)又稱為速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)，當(dāng)藥物作為抗原初次進(jìn)入體內(nèi)會(huì)引起免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體，致敏肥大細(xì)胞，而致敏的肥大細(xì)胞再次接觸相同抗原時(shí)會(huì)釋放組胺等活性介質(zhì)，引發(fā)多種病理性免疫反應(yīng)[9-10]。

注射用還原型谷胱甘肽導(dǎo)致的過(guò)敏反應(yīng)相對(duì)較少，但也有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生[6,11]，主要表現(xiàn)為皮疹、蕁麻疹、瘙癢等皮膚過(guò)敏癥狀，臉上蒼白、血壓下降、脈搏異常等類過(guò)敏癥狀，惡心、嘔吐、食欲不振等消化系統(tǒng)癥狀，甚至是過(guò)敏性休克等嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，在豚鼠ASA試驗(yàn)?zāi)┐沃旅魰r(shí)，注射用還原型谷胱甘肽鈉高劑量組動(dòng)物出現(xiàn)不安寧、跳躍等異常反應(yīng)。為進(jìn)一步研究這些異常反應(yīng)是否與藥物過(guò)敏反應(yīng)有關(guān)，另取4只健康豚鼠直接靜脈注射高劑量藥物制劑，動(dòng)物均未見異常，推斷致敏期間出現(xiàn)的異常癥狀非藥物過(guò)敏反應(yīng)引起。但對(duì)于這些異常癥狀產(chǎn)生原因是否與藥物毒性（高劑量約為人臨床劑量的11.25倍，低劑量約為人臨床劑量的5.6倍）或給藥方式（動(dòng)物致敏期間采用腹腔注射，藥物臨床給藥途徑為靜脈注射、肌肉注射）有關(guān)需進(jìn)一步討論研究。激發(fā)時(shí)，注射用還原型谷胱甘肽鈉低、高劑量動(dòng)物靜脈快速注射兩倍抗原后未引起全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)癥狀，ASA試驗(yàn)結(jié)果為陰性。在大鼠PCA試驗(yàn)中，試驗(yàn)佐劑選擇弗氏完全佐劑，致敏過(guò)程中做到與藥物充分混勻至油包水狀態(tài)，陽(yáng)性對(duì)照組得到了理想的試驗(yàn)結(jié)果，陽(yáng)性率達(dá)到100 %，試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致。注射用還原型谷胱甘肽鈉低、高劑量組未見藍(lán)斑，結(jié)果為陰性。

綜上，由豚鼠主ASA試驗(yàn)和大鼠PSA試驗(yàn)結(jié)果可知，注射用還原型谷胱甘肽鈉未引起過(guò)敏反應(yīng)，安全性良好，符合注射劑安全性要求。