劉 霞，張小剛，郭新艷，陳建英, ，劉 飛，凌沛學(xué),

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 博士后科研工作站 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗室，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，山東 濟(jì)南 250101 ）

近年，日益嚴(yán)重的空氣污染已成為我國大部分地區(qū)面臨的嚴(yán)重環(huán)境問題。研究發(fā)現(xiàn)空氣污染物中主要含二氧化硫、氮氧化物、煙堿和強(qiáng)致癌性的苯并芘、亞硝胺等有害成分[1]。流行病學(xué)研究表明空氣污染可誘發(fā)鼻腔炎性疾病，空氣污染嚴(yán)重的地區(qū)人群中流鼻涕、鼻子癢干、鼻塞、流鼻血、打噴嚏等癥狀發(fā)生率均高于空氣質(zhì)量良好的地區(qū)[2-3]。鼻腔黏膜上皮細(xì)胞作為鼻腔直接與空氣接觸的第一道天然防線，具有活躍的分泌功能，在外界理化因素的刺激下，釋放細(xì)胞因子作用于其他細(xì)胞，在鼻腔、鼻竇的慢性炎癥、損傷修復(fù)及重塑過程中發(fā)揮重要作用?？諝馕廴疚镆资购粑g鼻腔黏膜產(chǎn)生不適，適時對鼻腔進(jìn)行清洗，能在滋潤鼻腔黏膜的同時，起到抗菌作用。

玻璃酸（hyalouronic acid，HA）又名透明質(zhì)酸，是由D-葡糖醛酸（GlcA）和N-乙酰氨基葡糖（GlcNAc）雙糖單位通過交替的β-1, 3和β-1, 4糖苷鍵連接而成的線性高分子酸性黏多糖。HA是構(gòu)成皮膚細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，具有良好的吸濕性，能攜帶自身500倍以上的水分，是目前公認(rèn)的最佳天然保濕因子，廣泛應(yīng)用于眼科、骨科、保健品、化妝品等領(lǐng)域[4]。玻璃酸二甲基硅烷醇復(fù)合物（dimethyl silanol hyaluronate，DSHA）是HA的二甲基硅烷醇衍生物，研究表明DSHA無皮膚刺激性，無細(xì)胞毒性，與HA相比，保濕性更佳，研究發(fā)現(xiàn)DSHA還具有促進(jìn)皮膚角質(zhì)細(xì)胞增殖的作用[5]。目前市售鼻腔護(hù)理產(chǎn)品多以高滲或等滲鹽水和海水為主要成分，主要作用是對鼻腔的清洗。然而，日常使用鹽水或海水對鼻腔進(jìn)行清洗后，大部分鼻腔黏膜正常分泌的黏液被沖洗液帶走，空氣中的有害顆粒、霧霾成分和有害氣體直接接觸鼻腔黏膜表面，刺激黏膜引起鼻腔干癢癥狀，癥狀的解除依賴于新的黏液分泌。前期我們在研究中發(fā)現(xiàn) DSHA具有高效保濕、潤滑和減少黏濕感的優(yōu)點(diǎn)，與黏膜組織有較好的親和性，用于鼻腔沖洗液可在黏膜和纖毛表面形成較薄的液層，起到隔離和潤濕功能，可有效減輕鹽水或海水沖洗之后造成的鼻腔干癢癥狀。但含DSHA的鼻噴劑的細(xì)胞毒性及是否具有抑制空氣污染物對鼻黏膜上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，目前尚不清楚。

本研究采用噻唑藍(lán)（MTT）法對DSHA原料藥及含DSHA的鼻噴劑在鼻黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，并以苯并芘（BAP）刺激離體培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞，模擬霧霾對鼻黏膜的損傷，對DSHA的保護(hù)作用進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

倒置相差顯微鏡（Nikon）：酶標(biāo)儀（Tecan，Infinite M200 PRO）。

1.2 試劑

DSHA藥用原料，含DSHA的鼻噴劑，不含DSHA的鼻噴劑對照（山東福瑞達(dá)生物工程有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（FBS，Gibco）；青、鏈霉素（BI）；胰蛋白酶（Gibco）；MTT（Sigma）；二甲基亞砜（DMSO，上海生工）；BAP（Sigma）；腫瘤壞死因子α（TNF-α），白介素1（IL-1），IL-8檢測試劑盒（南京建成）；實(shí)驗用水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 鼻黏膜上皮細(xì)胞的分離

取新西蘭大白兔的鼻黏膜，用含雙抗（100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）、4 ℃預(yù)冷的PBS溶液對組織進(jìn)行沖洗，將菲薄的黏膜層從黏膜下組織小心地分離下來（略呈黃色的一面是上皮層），黏膜剪碎后加入0.1 % I型膠原酶消化（37 ℃孵育30 min），消化后在上述有黏膜塊的酶溶液內(nèi)直接加入等量的0.25 %胰蛋白酶，輕輕吹打5 min，移除黏膜塊，細(xì)胞懸液離心（1200 r/min，5 min），棄上清，細(xì)胞沉淀中加入適量含10 %FBS的培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

兔鼻黏膜上皮細(xì)胞加含10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于25 cm2培養(yǎng)瓶，于5 %CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.3 MTT法檢測DSHA的細(xì)胞毒性

取對數(shù)生長期的兔鼻黏膜上皮細(xì)胞，以1×105個/ml的密度，接種于96孔板，每孔100 μl，置5 %CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄掉96孔板中培養(yǎng)基，試驗組分別加入100 μl供試液。試驗組設(shè)正常組（加入新鮮培養(yǎng)基）、陰性對照組（加入生理鹽水）、鹽水鼻腔噴霧劑組（分別含0.001 %，0.002 %，0.003 %，0.004 %，0.005 %DSHA）、黏膜用DSHA原料組（分別含0.002 %，0.004 %，0.008 %，0.01 %，0.02 %，0.03 %，0.04 %，0.05 %DSHA），每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl ，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加入100 μl DMSO，搖床上低速振蕩10 min。震蕩平板，以酶標(biāo)儀測定各孔490 nm處的OD值，計算細(xì)胞相對增殖率。

2.4 DSHA對BAP引起的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用檢測

多環(huán)芳烴是一類常見的大氣中的有毒物質(zhì)，BAP是多環(huán)芳烴中毒性最大的一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，可對人類內(nèi)臟器官、神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，還會造成DNA的損傷，誘發(fā)細(xì)胞癌變[6-8]。BAP是最主要的大氣污染監(jiān)測對象之一。本研究以5 μg/ml BAP造模，模擬大氣污染對鼻黏膜細(xì)胞的損傷。取對數(shù)生長期的兔鼻黏膜細(xì)胞，以1×105個/ml的密度接種于96孔板，置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后加藥處理各測試組細(xì)胞。細(xì)胞分組：（1）正常組：每孔加入完全培養(yǎng)液（含10 %FBS）100 μl；（2）對照組：每孔加入含DMSO（最終質(zhì)量濃度0.2 %）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 μl；（3）BAP組：每孔加入含BAP（最終質(zhì)量濃度5 μg/ml）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液100μl；（4）BAP+DSHA組：每孔加入含BAP（最終質(zhì)量濃度5 μg/ml）和 DSHA（最終質(zhì)量濃度0.001 %）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 μl。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用MTT法檢測細(xì)胞存活率的變化。

2.5 細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1、IL-8含量的測定

提取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4 ℃，12000×g離心15 min，收集上清于冰上預(yù)冷的EP管中，分別采用TNF-α、IL-1和IL-8 ELISA檢測試劑盒，參照試劑盒說明書，檢測各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1和IL-8含量。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)來自3次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗，實(shí)驗采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間差異分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DSHA對兔鼻黏膜細(xì)胞的細(xì)胞毒性

細(xì)胞毒性結(jié)果見表1。由表1可見，DSHA原料在0.002 %～0.05 %的濃度范圍內(nèi)、鹽水鼻噴霧劑在0.001 %～0.005 %的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率均＞99 %，判定為無細(xì)胞毒性。

表1 DSHA對各組細(xì)胞存活率的影響

3.2 DSHA抑制BAP引起的鼻黏膜細(xì)胞的損傷

結(jié)果見圖1。由圖1可見，與正常組相比，對照組細(xì)胞存活率（60.59 %±1.74 %）顯著降低（P＜0.01）；與對照組相比，BAP處理組的細(xì)胞存活率顯著降低至48.18 %±1.63 % （P＜0.01），DSHA可顯著逆轉(zhuǎn)這一趨勢（P＜0.01），細(xì)胞存活率上升至62.14 %±1.87 %。這表明DSHA可顯著抑制BAP引起的鼻黏膜細(xì)胞存活率的下降。

圖1 DSHA對BAP引起的鼻黏膜細(xì)胞損傷的保護(hù)

3.3 DSHA對鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌的炎性因子的影響

研究表明，TNF-α、IL-1、IL-8作為促炎細(xì)胞因子，可趨化炎癥細(xì)胞并釋放炎性遞質(zhì)，在遲發(fā)超敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2,9]，在本研究中，我們對上述3個關(guān)鍵細(xì)胞因子進(jìn)行了研究，結(jié)果見表2。培養(yǎng)24 h后, 對照組與正常組相比，TNF-α、IL-1、IL-8 3種炎性因子的含量均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；BAP加入后，細(xì)胞中上述3種炎癥因子的含量均有不同程度的提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜ 0.01）；DSHA可顯著抑制BAP引起的TNF-α、IL-1、IL-8的含量升高（P＜0.05，P＜0.01）。綜上所述，含DSHA的鼻噴劑對BAP引起的鼻黏膜細(xì)胞存活率的下降有顯著抑制作用，且其發(fā)揮作用機(jī)制與抑制細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-8的高表達(dá)有關(guān)。

4 討論

隨著大氣污染的日益加重，患有鼻腔疾病的患者不斷增多，鼻腔護(hù)理相關(guān)制劑的開發(fā)成為近年研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。鼻腔疾病除了用藥，鼻腔清洗液的使用對于緩解鼻腔不適也多有益處。本研究發(fā)現(xiàn)，含DSHA的鼻噴劑及原料藥對鼻黏膜上皮細(xì)胞無細(xì)胞毒性，且可有效抑制BAP引起的鼻黏膜上皮細(xì)胞存活率的下降，降低炎性因子TNF-α、IL-1、IL-8的水平。這為DSHA開發(fā)為鼻腔護(hù)理用品或醫(yī)療器械產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。

表2 細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1、IL-8水平的變化