戴繼任徐彬鄭靜林樂(lè)希劉佳付勇*

1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(杭州310000)

2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院遺傳代謝科(杭州310000)

耳聾是影響人類健康的常見(jiàn)原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球共有耳聾患者3.6億，其中兒童占8.9%。我國(guó)殘疾人群有8296萬(wàn)，其中7歲以下的聾啞兒童數(shù)量高達(dá)80萬(wàn)，每年新增約11萬(wàn)聾兒[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，重度聽(tīng)力喪失的新生兒約為0.1%，其中一半屬遺傳性耳聾。另外還發(fā)現(xiàn)許多遲發(fā)性感音神經(jīng)性聽(tīng)力下降患者的發(fā)病是由于自身的基因缺陷或因基因缺陷和多態(tài)性造成了對(duì)致聾環(huán)境因素易感性的增加而致病[2]。因此，遺傳性耳聾的分子病因?qū)W研究非常重要。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月-2019年5月在我院耳鼻喉科門診確診的213例感音神經(jīng)性耳聾（單側(cè)或者雙側(cè)）患兒，年齡0～14歲，男童137例，女童94例。

1.2 診斷及評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn)：①出生時(shí)聽(tīng)力篩查未通過(guò)或者出生時(shí)聽(tīng)力篩查通過(guò)卻出現(xiàn)遲發(fā)性聽(tīng)力下降；②以耳聲發(fā)射、聲導(dǎo)抗及聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位、聽(tīng)覺(jué)穩(wěn)態(tài)（≤5歲不會(huì)配合純音測(cè)聽(tīng)的患兒）、以及純音測(cè)聽(tīng)（＞5歲且能配合患者）為檢測(cè)技術(shù)，診斷為感音神經(jīng)性聾（單側(cè)或者雙側(cè)）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：分泌性中耳炎、突發(fā)性耳聾、外中耳畸形的患者。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)1997年世界衛(wèi)生組織耳聾分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3]：大于5歲患兒以純音測(cè)聽(tīng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，選取500-1000-2000-4000Hz聽(tīng)閾的平均值。據(jù)此將聽(tīng)力損失進(jìn)行如下分級(jí)：（0級(jí)）正常：≤25dBHL（1級(jí)）輕度：26～40dBHL；（2級(jí)）中度：41～60dB；（3級(jí)）重度：6l～80dB；（4級(jí)）極重 度：＞81dB。小于5歲患兒以聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位（ABR）結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，ABR反應(yīng)閾＜35dBnHL為正常；36-50dBnHL為輕度聽(tīng)力下降；51-80dBnHL為中度聽(tīng)力下降；81-100dBnHL為重度聽(tīng)力下降；大于100dBnHL為極重度聽(tīng)力下降[4]。

1.3 研究方法

1.3.1 問(wèn)卷調(diào)查

在征得聾兒家長(zhǎng)同意下，采集受檢兒童相關(guān)信息，包括：聾兒基本信息、聽(tīng)力狀況、出生史、個(gè)人史、家族遺傳性耳聾病史、母孕期情況、干預(yù)情況、輔助檢查等（詳見(jiàn)表1）。在接受基因檢查前，均詳細(xì)告知家長(zhǎng)基因檢測(cè)目的、內(nèi)容，檢測(cè)局限性、檢測(cè)樣本及用途、檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和效力以及保密條款，并簽署了知情同意書。

1.3.2 ?？茩z查

213例患兒均接受耳鼻咽喉科常規(guī)檢查，排除外耳道鼓膜及中耳炎癥情況，以及全身系統(tǒng)性檢查。

1.3.3 聽(tīng)力學(xué)檢查

1.3.3.1 純音聽(tīng)閾測(cè)試

采用丹麥MADSEN Astera型純音聽(tīng)力儀，在噪音＜20dBSPL的隔聲室中，采用降10升5測(cè)試法測(cè)試250～8000Hz氣、骨導(dǎo)聽(tīng)閾閾值。選取500-1000-2000-4000HZ頻率的氣導(dǎo)聽(tīng)閾平均值作為主觀聽(tīng)閾。

1.3.3.2 電反應(yīng)測(cè)聽(tīng)檢測(cè)

采用美國(guó)智聽(tīng)公司生產(chǎn)的Smart EP腦干誘發(fā)電位儀，EAR-3A氣導(dǎo)插入式耳機(jī)。在隔音屏蔽室內(nèi)，按照常規(guī)方法進(jìn)行ABR檢查，以Ⅴ波反應(yīng)閾值作為客觀聽(tīng)閾。

1.3.3.3 聲導(dǎo)抗測(cè)聽(tīng)檢測(cè)

采用丹麥國(guó)際Madsen公司的Titan中耳分析儀，EAR-3A插入式耳機(jī)，≤6個(gè)月嬰兒用1KHz探測(cè)音，＞6個(gè)月且＜12個(gè)月小兒同時(shí)用1KHz和226Hz探測(cè)音進(jìn)行檢測(cè)，＞12個(gè)月小兒采用226Hz探測(cè)音進(jìn)行檢測(cè)，以單峰A型聲導(dǎo)抗圖為正常。

1.3.3.4 耳聲發(fā)射

采用GSI耳聲發(fā)射儀對(duì)患兒進(jìn)行初步篩查，使用插入式耳機(jī)，對(duì)患兒進(jìn)行 500、1000、2000、4000HZ頻率檢測(cè)，4個(gè)頻率均通過(guò)為正常。

1.3.4 影像學(xué)檢查

對(duì)于明確診斷為感音神經(jīng)性聾的患兒進(jìn)行顳骨高分辨率水平+冠狀位薄層CT檢查，或行頭顱/內(nèi)聽(tīng)道磁共振檢查。

1.3.5 耳聾基因檢測(cè)

采集受檢者2-3ml的外周血，使用EDTA抗凝，注入統(tǒng)一專用真空采血管，統(tǒng)一編號(hào)，并在冷凍室儲(chǔ)藏，及時(shí)送檢。具體相關(guān)流程如下:1、詢問(wèn)病史，一般體格檢查及耳科檢查、完成其他相關(guān)檢查，確診為感音神經(jīng)性聾。2、完成《感音神經(jīng)性聾的臨床資料收集表》的填寫并建立檔案。3、確認(rèn)是否要進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)，完成《耳聾基因知情同意書》。4、予以收集患兒及父母雙親的外周血并及時(shí)送檢。5、對(duì)耳聾基因結(jié)果予以解讀及分析，并予以遺傳咨詢，提出治療或康復(fù)建議。

1.3.6 判定標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)（ACMG）發(fā)布的變異解讀指南進(jìn)行致病性分析：pathogenic/致病性變異；likely pathogenic/疑似致病性變異；uncertain/臨床意義未明變異；likely-benign/疑似良性變異；benign/良性變異。本檢測(cè)只報(bào)告根據(jù)ACMG分級(jí)為“致病”、“疑似致病”、“臨床意義未明”的變異，不報(bào)告“良性”及“疑似良性”等不具有臨床意義的變異。

2 結(jié)果

2.1 耳聾情況

在213例樣本中，輕度感音神經(jīng)性聾為39例，占18.3%，中度感音神經(jīng)性耳聾45例，占21.1%，重度感音神經(jīng)性聾38例占17.8%，極重度感音神經(jīng)性聾91例，占42.7%.

2.2 高危因素

統(tǒng)計(jì)了71份完整問(wèn)卷表格中，與耳聾相關(guān)的高危因素主要是新生兒高膽紅素血癥，占8.5%，耳聾家族史占7%，早產(chǎn)兒占5.6%，宮內(nèi)感染和新生兒窒息分別占2.8%，耳廓和其他的顱面部畸形和極低體重兒分別占1.4%。

表1 感音神經(jīng)性聾的臨床資料收集表Table 1 Clinical data collection table for sensorineural hearing loss

2.3 內(nèi)耳畸形

本研究中有172例患兒進(jìn)行了高分辨率水平+冠狀位薄層螺旋CT檢查，以Sennaroglu[5]2010分類為標(biāo)準(zhǔn)，172例感音神經(jīng)性耳聾患者高分辨率水平+冠狀位薄層螺旋CT檢查的結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 43例內(nèi)耳畸形分布情況Table 2 Distribution of 43 cases of inner ear malformation

2.4 致病基因及突變熱點(diǎn)

213例感音神經(jīng)性聾患兒中，陽(yáng)性報(bào)告56例（26.3%），疑似陽(yáng)性報(bào)告52例（24.4%），未明確報(bào)告16例（7.5%），陰性報(bào)告89例（41.8%）。在陽(yáng)性報(bào)告、疑似陽(yáng)性報(bào)告和未明確報(bào)告中主要以GJB2、SLC26A4、USH2A、MYO15A、CDH23、MYO7A突變?yōu)橹鳎ㄔ斠?jiàn)表3）。

表3 124例陽(yáng)性報(bào)告中各個(gè)基因的統(tǒng)計(jì)報(bào)告Table 3 Statistical reports of each gene in 124 positive reports

在47例GJB2基因突變樣本中，以c.235delC位點(diǎn)突變?yōu)橹鞯募兒贤蛔?8例，以c.235delC和c.109G＞A位點(diǎn)復(fù)合雜合突變?yōu)橹鞯碾s合突變19例。在12例SLC26A4基因突變樣本中，純合突變6例，雜合突變6例（詳見(jiàn)表4和表5）。

表4 陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果中的純合突變Table 4 Homozygous mutations in positive test results

表5 陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果中的雜合突變Table 5 Hybrid mutations in positive test results

在陽(yáng)性報(bào)告、疑似陽(yáng)性報(bào)告和未明確報(bào)告中，108例患兒進(jìn)行了聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位（ABR）檢查，結(jié)果顯示極重度感音神經(jīng)性耳聾患兒最多，有46例。GJB2基因c.235delC位點(diǎn)、c.109G＞A位點(diǎn)突變和SLC26A4基因c.919-2A＞G位點(diǎn)突變?cè)谠?08例患兒中占多數(shù)（詳見(jiàn)表6）。

表6 在陽(yáng)性報(bào)告樣本中各級(jí)耳聾病例中主要的基因突變例數(shù)Table 6 Number of major gene mutations in deafness cases at all levels in positive report samples

3 討論

在本次研究中發(fā)現(xiàn)重度、極重度感音神經(jīng)性聾為主，占60.3%。本研究中重度、極重度感音神經(jīng)性耳聾比例與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的54.55%—70.43%比例相接近[6,7]。

3.1 高危因素

統(tǒng)計(jì)了71份完整問(wèn)卷表格中，與耳聾相關(guān)的高危因素依次是新生兒高膽紅素血癥、耳聾家族史、早產(chǎn)兒、宮內(nèi)感染、新生兒窒息、耳廓畸形和極低體重兒。根據(jù)楊波等人的研究顯示高危因素依次為早產(chǎn)、新生兒高膽紅素血癥、NICU住院時(shí)間≥5 d[8]。由于本次研究樣本量較少，無(wú)法做出相關(guān)性研究，但從結(jié)論中可以發(fā)現(xiàn)本次研究中得出的耳聾高危因素占比與相關(guān)研究結(jié)果相似。

3.2 內(nèi)耳畸形

前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大是最常見(jiàn)的內(nèi)耳畸形類型，診斷標(biāo)準(zhǔn)為高分辨率顳骨CT顯示總腳至前庭水管外口的連線上前庭水管的寬度超過(guò)1.5mm[9]。本研究中最常見(jiàn)的畸形是單純性前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，占58.1%（25/43）；其次是半規(guī)管畸形占16.3%（7/43）；耳蝸畸形占16.3%（7/43）。這與李幼靖等對(duì)NSHL聽(tīng)力損失患者[10]的研究趨勢(shì)相同。但本研究的畸形發(fā)生率較低，這可能與本研究的樣本數(shù)量較少有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)單純性前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大患者經(jīng)人工耳蝸植入術(shù)后，均獲得良好的助聽(tīng)效果。另外，在本研究中發(fā)現(xiàn)共同腔畸形2例。此種畸形的患者術(shù)前需進(jìn)行MRI和電誘發(fā)聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)（EABR）檢查，從而確認(rèn)是否存在蝸神經(jīng)及前庭神經(jīng)，預(yù)估人工耳蝸植入術(shù)后效果。目前該2例患兒暫未行人工耳蝸手術(shù)。

3.3 耳聾基因檢測(cè)技術(shù)

NGS是在Sanger測(cè)序方法的基礎(chǔ)上得到進(jìn)一步發(fā)展和創(chuàng)新的，通過(guò)把大量被檢測(cè)的模板DNA片段放在芯片上固定，并進(jìn)行雜交結(jié)合通用的DNA引物，利用不同的方法分別控制4種堿基在DNA引物上的延伸，通過(guò)檢測(cè)延伸反應(yīng)過(guò)程或堿基，實(shí)現(xiàn)DNA序列信息的檢測(cè)[11]。高通量測(cè)序技術(shù)通過(guò)增加更多個(gè)體、更多基因編碼區(qū)更深層次的覆蓋度，來(lái)獲取準(zhǔn)確性更高的數(shù)據(jù)，已成為現(xiàn)階段在基因組水平上發(fā)現(xiàn)致病基因的有效手段。

3.4 耳聾基因

根據(jù)數(shù)據(jù)顯示[12]，在歐美人群中常見(jiàn)的耳聾基因是 GJB2、SLC26A4、MYO15A、OTOF、CDH23 和TMC1，其中最常見(jiàn)的耳聾基因?yàn)镚JB2。在我國(guó)，GJB2、SLC26A4、線粒體基因 mtDNA（A1555G 和C1494T突變）是最為常見(jiàn)的耳聾基因[13]。本次研究GJB2基因突變檢出率為22.1%；SLC26A4基因突變?yōu)?.63%；USH2A基因突變?yōu)?.29%；MYO15A基因突變?yōu)?.82%；CDH23基因突變?yōu)?.41%。這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。USH2A、MYO15A、CDH23、MYO7A基因突變也有不同程度的檢出。

3.4.1 GJB2基因

GJB2基因在普通耳聾群體中檢出率約為15%～25%[14]。本研究發(fā)現(xiàn)47例患者存在GJB2基因單雜合或雙雜合突變，檢出率為22.1%。根據(jù)戴樸教授等研究結(jié)果顯示，在我國(guó)GJB2基因檢出率為21.01%[15]，而本次研究結(jié)果與戴樸教授等研究結(jié)果相近，且略微高于戴樸教授等的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)GJB2基因純合突變28例，復(fù)合雜合突變19例。其中有8例極重度感音神經(jīng)性聾的患兒行人工耳蝸植入術(shù),術(shù)后獲得良好助聽(tīng)效果。因此，我們認(rèn)為GJB2基因突變相關(guān)的感音神經(jīng)性耳聾患者行人工耳蝸植入手術(shù)后效果良好。這與相關(guān)研究[16]結(jié)果相一致。

3.4.2 SLC26A4基因

本次研究發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因突變檢出率僅次于GJB2，檢出率為5.63%。低于戴樸等研究的SLC26A4基因突變檢出率14.5%。究其原因可能是本次研究樣本數(shù)量較戴樸等研究的少，檢測(cè)對(duì)象重度以上耳聾比例存在差異所致。

SLC26A4基因突變與單純前庭水管擴(kuò)大和(或)內(nèi)耳畸形有密切的關(guān)系[17]。在我國(guó)，約96%的前庭水管擴(kuò)大的患者由SLC26A4基因突變致病。SLC26A4基因突變?cè)谌巳褐械臋z出率為20.35%(雙等位基因突變19.43%，單等位基因突變0.92%)，SLC26A4基因（c.919-2A＞G）突變是中國(guó)大前庭水管患者群的熱點(diǎn)突變[18]。本次研究中有12例確診為SLC26A4基因（c.919-2A＞G）突變，其中純合突變6例，雜合突變6例，為該樣本人群的熱點(diǎn)突變。本研究中的12例SLC26A4基因突變患兒，其顳骨CT均提示前庭水管擴(kuò)大，這12例患兒甲狀腺無(wú)明顯腫大，其中4例行人工耳蝸植入術(shù)，術(shù)后預(yù)后良好。

3.4.3 MYO15A基因

MYO15A基因突變可以導(dǎo)致常染色體隱性遺傳非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾。MYO15A編碼的肌球蛋白XVa可以維持耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白組織結(jié)構(gòu)及毛細(xì)胞靜纖毛的伸長(zhǎng)[19]。相關(guān)研究[20]表明N-末端區(qū)域發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白亞型異常，聽(tīng)力表型為有殘余聽(tīng)力的非重度極重度感音神經(jīng)性聾。而非N-末端 區(qū) 域（Motor、MyTH4 1、FERM1、SH3、MyTH4 2、FERM2及PDZ結(jié)構(gòu)域）發(fā)生的突變，聽(tīng)力表型多為先天性或語(yǔ)前性全頻重度-極重度感音神經(jīng)性耳聾。在本研究中有5例MYO15A基因突變患兒為重度以上神經(jīng)性耳聾，有1例為輕度感音神經(jīng)性耳聾。MYO15A基因研究對(duì)感音神經(jīng)性聾的診斷以及對(duì)感音神經(jīng)性耳聾患兒的聽(tīng)力干預(yù)具有意義。

3.4.4 TMC1基因

在本次研究中發(fā)現(xiàn)一份TMC1基因復(fù)合雜合突變報(bào)告。該基因有2個(gè)突變位點(diǎn)，突變位點(diǎn)為c.16+2T＞C/c.969C＞G。c.16+2T＞C導(dǎo)致氨基酸改變，為剪接突變。根據(jù)ACMG指南，該變異初步判定為致病性變異（Pathogenic）。c.969C＞G（編碼區(qū)第969號(hào)核苷酸由胞嘧啶變異為鳥(niǎo)嘌呤），導(dǎo)致氨基酸改變p.Y323X，為無(wú)義突變。根據(jù)ACMG指南，該變異初步判定為致病性變異（Pathogenic）。對(duì)于c.969C＞G（編碼區(qū)第969號(hào)核苷酸由胞嘧啶變異為鳥(niǎo)嘌呤）的突變分析已經(jīng)明確[21]，即導(dǎo)致氨基酸改變p.Y323XTCA1無(wú)義突變。但是在TMC1基因中發(fā)生了c.16+2T＞C變異，剪接突變導(dǎo)致對(duì)蛋白產(chǎn)物的影響。因此，我們接下來(lái)將進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明這一問(wèn)題。

3.5 干預(yù)方法

在我院門診確診的3月齡以上的中重度感音神經(jīng)性耳聾患兒，均予以配戴助聽(tīng)器，干預(yù)期3-6個(gè)月。重度-極重度感音神經(jīng)性耳聾患兒經(jīng)3-6個(gè)月助聽(tīng)器干預(yù)后未能得到滿意的助聽(tīng)效果，則排除相關(guān)手術(shù)禁忌后，予以行人工耳蝸植入。絕大多數(shù)聾兒術(shù)后取得較好的助聽(tīng)效果，但仍有部分聾兒無(wú)明顯效果，推測(cè)其原因可能與基因突變導(dǎo)致的病變部位有關(guān)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[22]，人工耳蝸植入術(shù)后效果良好的有以下幾個(gè)基因：GJB2、SLC26A4、12SrRNA（MT-RNR1：A1555G、C1494T）、OTOF、CDH23、MYO6、MYO7A、KCNQ1、TMC1、COCH、LOXHD1、MYO15A、TECTA、ACTG1、TMPRSS3；不確定的有：MYH9、POU3F4、PCDH15；植入效果差的有：CHD7、TIMM8A、DFNB59。因此，通過(guò)基因檢測(cè)，推斷出可能的分子病因，預(yù)測(cè)人工耳蝸植入后的效果，為遺傳性聾的早期診斷和個(gè)體化治療提供理論依據(jù)，為耳聾患者提供更精準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明應(yīng)用NGS可檢測(cè)耳聾大樣本群體中的相關(guān)基因突變，有助于發(fā)現(xiàn)以及明確新的、非熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，提高相關(guān)基因突變的檢出率，同時(shí)也將為感音神經(jīng)性耳聾患兒及其家屬提供更全面的遺傳信息。當(dāng)然在臨床診療過(guò)程中需同時(shí)關(guān)注內(nèi)耳畸形及耳聾相關(guān)的新生兒高危因素，為遺傳性聾的早期診斷和個(gè)體化治療提供技術(shù)支持，為感音神經(jīng)性耳聾患者提供更精準(zhǔn)的診療依據(jù)，并予以及早干預(yù)。