李瓊 梁鵬飛 王淑娟 李薇 王劍 邱建華 查定軍

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

耳聾是一種常見的出生缺陷，我國新生兒先天性耳聾的發(fā)生率約為1/1000-3/1000[1,2]。2006年，第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國聽力言語殘疾者人數(shù)為2780萬[3]，耳聾嚴重影響我國出生人口素質(zhì)及患者生活質(zhì)量，給患者家庭與社會帶來沉重的負擔(dān)。遺傳因素、環(huán)境因素或者兩者共同作用導(dǎo)致耳聾的發(fā)生，其中遺傳因素占50%以上[4,5]。因此，如果在婚前或孕前對有生育需求的育齡夫婦進行遺傳性耳聾基因檢測及相關(guān)遺傳咨詢，可以明確遺傳學(xué)病因，為該家庭的生育計劃進行風(fēng)險評估，有效預(yù)防聾兒出生。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象

選取2009年3月至2018年7月在空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科聾病基因診斷中心就診的183對夫妻，共366個受檢者。其中男183例，女183例，均為育齡且有生育需求的家庭。每位自愿接受基因檢測的患者，明確其非綜合征性感音神經(jīng)性耳聾診斷，經(jīng)知情告知并簽署知情同意書后，進行純音聽閾測試、聲導(dǎo)抗、耳聲發(fā)射（DPOAE）、聽性腦干反應(yīng)（ABR）、言語識別率、眼震電圖（ENG）、前庭誘發(fā)肌源電位（VEMP）以及顳骨CT掃描等多項檢查，按照要求采集患者基本信息、耳聾病史、母親孕產(chǎn)期情況、耳毒性藥物使用史、頭部外傷史、傳染病史、家族史等相關(guān)信息，建立詳盡的病歷檔案，進行標本采集，行孕前耳聾基因檢測。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集與處理

采集受試者外周靜脈血2-3mL，2.0mg/mL EDTA.K2抗凝，統(tǒng)一編號，無菌保存待檢。所有血樣使用康為世紀血液基因組非柱式提取試劑盒CW0544M進行DNA提取，使用博奧生物有限公司微型分光光度計檢測DNA濃度及純度。置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)冰融。

1.2.2 耳聾基因測序

根據(jù)NCBI提供的相關(guān)基因標準序列，針對GJB2基因全序列、SLC26A4基因編碼區(qū)內(nèi)的20個外顯子及剪切位點和線粒體DNA 12S rRNA含1494和1555位點的序列，運用Primer 5.0軟件設(shè)計引物[6]，對目的DNA片段進行PCR擴增（PCR反應(yīng)程序、溫度、時間等參數(shù)設(shè)置參考文獻[7]），并送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進行Sanger測序。

1.2.3 測序結(jié)果分析

應(yīng)用SeqMan軟件將測序結(jié)果與NCBI提供的人類SLC26A4、GJB2及線粒體DNA 12S rRNA的標準序列進行比對，并利用Chromas軟件結(jié)合測序峰圖，分析是否存在變異位點。若發(fā)現(xiàn)變異位點，重新進行PCR擴增、反向測序以及序列比對，進行驗證。確定變異位點后，在http://deafnessvariationdatabase.org/以 及 http://davinci.crg.es/deafness/網(wǎng) 站 上進行比較，明確變異位點是否為已知致病變異。

2 結(jié)果

在183對受檢夫妻中，124對夫妻檢測到致聾基因變異，占67.76%（124/183）；90對夫妻有生育耳聾患兒的風(fēng)險，占49.18%（90/183）。

2.1 研究對象統(tǒng)計

所有受檢者均為單純耳聾或聽力正常人員，不合并其他疾病，排除了綜合征性耳聾及感染所致耳聾。受檢者年齡分布在17～46歲之間，通過參看聽力學(xué)報告并結(jié)合語聲測試法評估受檢者聽力情況，聾人 62 例，占16.94%（62/366），非聾人304例，占83.06%（304/366）。受檢者家族史及生育史等相關(guān)信息如表1所示。

表1 受檢者聽力情況、家族史及生育史Table 1 Subject's hearing,family history and birth history

2.2 GJB2基因變異檢測結(jié)果

本研究共檢出17種GJB2基因變異方式；有64對夫妻攜帶GJB2基因致病性變異，占34.97%（64/183）；有43對夫妻有生育GJB2雙等位基因變異耳聾患兒的風(fēng)險，占23.49%（43/183）；有21對夫妻雖攜帶GJB2基因致病變異，但并無生育耳聾患兒的風(fēng)險，其后代僅為GJB2基因致病變異攜帶者，占11.48%（21/183）。

表2 GJB2基因變異檢測結(jié)果Table 2 GJB2 genetic variation test results

2.3 SLC26A4基因變異檢測結(jié)果

本研究共檢出41種SLC26A4基因變異方式；有68對夫妻攜帶SLC26A4基因致病性變異，占37.16%（68/183）；有44對夫妻有生育SLC26A4雙等位基因變異耳聾患兒的風(fēng)險，占24.04%（44/183）；有24對夫妻雖攜帶SLC26A4基因致病變異，但并無生育耳聾患兒的風(fēng)險，其后代僅為SLC26A4基因致病變異攜帶者，占13.11%（24/183）。

2.4 線粒體12S rRNA基因變異檢測結(jié)果

本研究共檢出6對夫妻有線粒體12SrRNA m.1555 A＞G均質(zhì)變異，占3.28%（6/183）；有4對夫妻，其妻子為m.1555 A＞G均質(zhì)變異，后代將遺傳此突變，占 2.19%（4/183）；有 2對夫妻，僅丈夫為m.1555 A＞G均質(zhì)變異，此突變將不會遺傳給后代1.09%（2/183）。

2.5 多個基因共同變異檢測結(jié)果

表3 SLC26A4基因變異檢測結(jié)果Table 3 SLC26A4 genetic variation test results

本研究共有14對夫妻同時攜帶兩種基因的變異。其中，有12對夫妻同時攜帶SLC26A4及GJB2基因變異；有1對夫妻同時攜帶SLC26A4及線粒體12SrRNA基因變異；有1對夫妻同時攜帶GJB2及線粒體12SrRNA基因變異。在這14對夫妻中，有10對夫妻有生育耳聾患兒的風(fēng)險，有4對夫妻雖攜帶多個基因的致病變異，但并無生育耳聾患兒的風(fēng)險，其后代僅為SLC26A4或/及GJB2基因致病變異攜帶者。

表3 下半部分

表4 線粒體12S rRNA基因變異檢測結(jié)果Table 4 Mitochondria 12S rRNA genetic variation test results

3 討論

遺傳性耳聾包括綜合征性耳聾（syndromic hearing loss,SHL）和非綜合征性耳聾（non-syndromic hearing loss,NSHL）兩大類，我國自2003年開始的全國大范圍聾病分子流行病學(xué)調(diào)查研究數(shù)據(jù)顯示，GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA（m.1555A＞G和m.1494C＞T）是導(dǎo)致我國非綜合征性耳聾患者發(fā)病最常見的三個基因[8,9]，在耳聾人群中的攜帶率分別為 21%[10]、14.5%[11]、3.4%和 0.6%[12]。本中心前期調(diào)查研究結(jié)果顯示，陜西省GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA致病變異發(fā)生率分別為23.88%、18.88%和2%[7]，與全國及西北地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)相比較為一致。

GJB2基因編碼縫隙連接蛋白26（connexin 26，Cx26），在信息傳遞及物質(zhì)交換中起著重要作用，若發(fā)生變異會使鉀離子無法回流至內(nèi)淋巴液，導(dǎo)致耳聾[13]。該基因大部分變異方式表現(xiàn)為隱性遺傳，約50%的非綜合征性常染色體隱性遺傳性耳聾患者攜帶GJB2基因變異[14]，是非綜合征性耳聾最常見的遺傳基因。本研究中，64對夫妻檢出GJB2致病變異，其中46對夫妻檢出GJB2 235delC變異，占71.88%（46/64）；43對夫妻有可能生育GJB2雙等位基因變異的后代，其中14對夫妻有生育GJB2 235delC純合變異后代的風(fēng)險，占32.56%（14/43），符合235delC為中國地區(qū)最常見GJB2基因變異的結(jié)論[15-17]。

SLC26A4基因編碼Pendrin蛋白，若發(fā)生變異會使Pendrin蛋白的合成和功能受到影響，引起Pendred綜合征[18]及前庭導(dǎo)水管擴大[19]。前庭導(dǎo)水管擴大患者聯(lián)系內(nèi)耳和顱腔的通道異常腫大，感冒、碰撞等可引起顱內(nèi)壓變化的因素，均會導(dǎo)致患者聽力下降，在這類患者中SLC26A4基因變異檢出率高達97%。本研究中，68對夫妻檢出SLC26A4致病變異，其中42對夫妻檢出919-2A＞G變異，占61.76%（42/68），符合c.919-2A＞G變異在SLC26A4基因變異中最常見的報道[20,21]。

表5 多個基因共同變異檢測結(jié)果Table 5 Multiple gene common variation test results

線粒體12S rRNA m.1555A＞G及m.1494C＞T陽性個體變異后，對氨基糖苷類抗生素異常敏感，藥物耳毒性不呈現(xiàn)劑量依賴，極少用量即可致聾[22]。該變異具有母系遺傳特征[23]，可通過母親傳給后代，后代中女性將變異繼續(xù)傳至下一代。

目前，耳聾基因檢測常采用手段有耳聾基因芯片、Sanger測序以及高通量測序等。隨著技術(shù)的發(fā)展更新和耳聾基因及致病位點的逐步明確，耳聾基因檢出率不斷提高。耳聾基因芯片法具有快速、高效、成本低、準確率高等優(yōu)點，在耳聾基因檢測中廣泛應(yīng)用。本研究采用Sanger測序法對GJB2、SLC26A4及線粒體12SrRNA的1494和1555位點等進行耳聾基因檢測，共檢出59種致聾基因變異，覆蓋的位點遠高于最常用的基因芯片法的9個位點。所有受檢者中，共有62例聾人，其中37例檢出耳聾基因變異，檢出率為59.68%（37/62）；共有304例非聾人，其中180例檢出耳聾基因變異，檢出率為59.21%（180/304），高于利用基因芯片法對耳聾高危人群進行檢測的致聾基因檢出率，如張旭等報道的43.6%[24]、胡煜等報道的44.1%[25]和王荷溪等報道的55.2%[26]。

本研究通過耳聾基因檢測，明確有生育需求的夫妻雙方耳聾基因的變異類型，以此為依據(jù)，分析其生育耳聾患兒的風(fēng)險，提供精準恰當(dāng)?shù)倪z傳咨詢，防止耳聾患兒出生，降低遺傳性耳聾發(fā)病率[26]。值得注意的是，本研究進行的孕前耳聾基因診斷以及生育風(fēng)險評估，均基于夫妻雙方已經(jīng)明確的耳聾基因變異。導(dǎo)致耳聾的因素眾多、病因復(fù)雜且目前已知的耳聾基因成百上千。若受檢者GJB2、SLC26A4及線粒體12SrRNA三種基因均正常，并不能代表該受檢者不攜帶耳聾基因，也不能代表其后代無耳聾風(fēng)險。需進一步進行家系調(diào)查、環(huán)境因素調(diào)查并擴大進行其他耳聾基因變異的檢測，以防漏診。

例1：表2中的1號家庭，受檢者為夫妻雙方，男方29歲，女方26歲，陜西西安人，二人均為極重度感音神經(jīng)性耳聾患者，且顳骨CT均顯示雙側(cè)前庭導(dǎo)水管擴大。檢測結(jié)果顯示，男方為SLC26A4c.589G＞A/c.1343C＞T復(fù)合雜合變異，女方為SLC26A4 c.919-2A＞G/c.1174A＞T復(fù)合雜合變異。告知該夫妻SLC26A4基因的遺傳規(guī)律，預(yù)測其后代必定為SLC26A4復(fù)合雜合變異，即二人生育的后代100%面臨耳聾風(fēng)險。不建議該夫妻進行生育，或可選擇供精方式生育后代。

例2：表5中的11號家庭，受檢者為夫妻雙方，男方30歲，女方29歲，陜西渭南人，二人均為極重度感音神經(jīng)性耳聾患者，男方診斷為雙側(cè)前庭導(dǎo)水管擴大。檢測結(jié)果顯示，男方為SLC26A4c.919-2A＞G/c.2027T＞A復(fù)合雜合變異，女方為GJB2 c.235delC純合變異。告知該夫妻SLC26A4基因及GJB2基因的遺傳規(guī)律，預(yù)測其后代必定為SLC26A4及GJB2基因雜合變異攜帶者，但并不影響聽力，可生育聽力正常后代。其后代成年后進行婚配時，其對象需進行耳聾基因檢測，避免同證婚配生育耳聾患兒。

例3：表5中的13號家庭，受檢者為夫妻雙方，男方30歲，女方32歲，陜西西安人，二人均為極重度感音神經(jīng)性耳聾患者，男方先天性耳聾，女方4歲前聽力正常，因使用氨基糖苷類藥物致聾。檢測結(jié)果顯示男方為GJB2 c.235delC純合變異，女方為線粒體12SrRNA m.1555A＞G均質(zhì)變異。告知該夫妻GJB2基因及線粒體DNA的遺傳規(guī)律。預(yù)測其后代必定為GJB2基因雜合變異，且線粒體12SrRNA m.1555A＞G為母系遺傳，線粒體基因及環(huán)境因素等共同作用決定后代的聽力狀況，線粒體DNA無法通過產(chǎn)前診斷預(yù)測胎兒表型，其后代需要謹慎使用氨基糖苷類藥物，并密切觀察聽力變化。

例4：表2中的27號家庭，受檢者為夫妻雙方及第一胎聾兒，男方37歲，女方35歲，陜西渭南人，夫妻二人聽力正常，育有一子為極重度感音神經(jīng)性耳聾。檢測結(jié)果顯示，聾兒為GJB2 c.134G＞A/408C＞A/c.313del14bp變異，男方為GJB2c.313del14bp雜合變異，女方為GJB2 c.134G＞A/c.408C＞A雙位點變異。女方雖攜帶有2個已知的GJB2致病性變異，但由于2個變異位于同一條DNA鏈上，等同于GJB2單雜合變異，所以聽力正常。告知該夫妻GJB2基因的遺傳規(guī)律，預(yù)測若生育二胎，25%幾率為GJB2野生型，50%幾率為GJB2雜合變異攜帶者，25%幾率為GJB2雙等位基因變異，即有25%幾率生育聾兒。

我國每年約有2000萬孕齡夫婦生育，估算每年新增聾兒3萬以上，對家庭和社會均造成沉重負擔(dān)，防聾治聾工作形勢嚴峻，任務(wù)艱巨。為減少出生缺陷，WTO提出了三級預(yù)防策略。以此策略為理論基礎(chǔ)，構(gòu)成了先天性耳聾的三級防控體系[28]。目前新生兒聽力及耳聾基因篩查[29,30]、聽障兒童聽覺言語康復(fù)（三級預(yù)防）和耳聾基因產(chǎn)前診斷（二級預(yù)防）研究較多，先天性耳聾防控已取得一定的效果。對重點懷疑和高危人群的耳聾基因篩查及婚育指導(dǎo)（一級預(yù)防）需進一步加大推進力度，對耳聾高危人群進行基因篩查與診斷、提供個性化的遺傳咨詢以及婚育指導(dǎo)，可有效實現(xiàn)遺傳性耳聾的一級預(yù)防[31]，從根本上降低先天性耳聾患兒的出生率，杜絕遺傳性耳聾的發(fā)生，最終實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。