溫超，王春梅，楊柳

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧 大連 116011）

蛇床子素是中藥蛇床子主要有效成分，具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用［1-2］。有研究［3］發(fā)現(xiàn)硬膜外腔注射蛇床子素能夠緩解髓核引起的坐骨神經(jīng)痛大鼠的疼痛行為。慢性坐骨神經(jīng)壓迫 （chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI） 模型是研究外周神經(jīng)不完全損傷的病理性疼痛的動物模型［4］。髓樣分化因子88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）是Toll樣受體 （Toll-like receptor，TLR） 信號通路中的關(guān)鍵接頭分子，CCI模型大鼠能夠激活MyD88依賴性信號通路，引起下游蛋白細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK） 激活為磷酸化ERK （phosphated ERK，p-ERK）［5］。研究［6］顯示蛇床子素能夠通過抑制脊髓背角p-ERK活化下調(diào)COX-2mRNA表達(dá)，對髓核導(dǎo)致的神經(jīng)根炎性痛發(fā)揮明顯的鎮(zhèn)痛作用。本研究檢測蛇床子素治療后CCI大鼠背根神經(jīng)節(jié) （dorsal root ganglion，DRG） 中MyD88與p-ERK表達(dá)變化，旨在明確蛇床子素緩解慢性神經(jīng)病理性疼痛的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗試劑、動物及分組

蛇床子素 （美國Selleck Chemicals公司），β-actin抗體、MyD88抗體 （英國Abcam公司），ERK和p-ERK（美國Cell Signaling 公司）。24只SD大鼠 （180～200 g，雌性） 由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實(shí)驗中心提供，并獲得大連醫(yī)科大學(xué)動物管理倫理委員會批準(zhǔn)。大鼠自由飲水，鼠糧充足，每天照明12 h/關(guān)燈12 h，適宜溫度、濕度飼養(yǎng)。大鼠在進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗前適應(yīng)測試環(huán)境1 h。實(shí)驗大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組 （sham組）、CCI組、治療組，每組8只。手術(shù)后14 d完成動物行為測試，然后進(jìn)行DRG取材。

1.2 CCI模型制作

在CCI手術(shù)前，掀開大鼠L6的硬脊膜，沿蛛網(wǎng)膜下腔向頭端置入 PE-10導(dǎo)管 （美國Smiths Medical International公司） 約5 cm，隨后縫皮固定導(dǎo)管，1 d后進(jìn)行坐骨神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)。大鼠腹腔注射l%戊巴比妥鈉后麻醉，參照Bennett-Xie模型制作CCI模型［4］。暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)干后用4-0鉻制羊腸線圍繞其進(jìn)行4個結(jié)扎環(huán)，結(jié)扎環(huán)之間間隔1 mm。sham組大鼠只暴露不做結(jié)扎。治療組硬膜外注射50 μL蛇床子素［溶于二甲基亞砜，體積濃度為2% （20 mg/mL）；美國Sigma公司］。3組大鼠均進(jìn)行相同鞘內(nèi)置管，相同給藥時間sham組與CCI組大鼠注射相同體積的生理鹽水。大鼠術(shù)后均注射青霉素預(yù)防感染。

1.3 大鼠機(jī)械疼痛閾值測定

將待測大鼠放在一個長方體的有機(jī)玻璃盒中，放在金屬網(wǎng)格上。用Von Frey電子測痛儀 （美國 IITC Life Science公司） Von Frey絲 （直徑200 μm） 垂直刺激大鼠的右后足，觀察大鼠的縮足反應(yīng) （右后足縮足、舔足或揚(yáng)足反應(yīng)為陽性反應(yīng)），使用后足機(jī)械縮足閾值 （paw mechanical withdrawal threshold，PMWT）評價大鼠對機(jī)械刺激所產(chǎn)生的疼痛。機(jī)械刺激間隔時間＞10 min，反復(fù)測量3次，取平均值。

1.4 大鼠熱痛閾值測定

將大鼠放在透明玻璃籠 （底部厚為0.22 mm，20 cm×20 cm×40 cm） 中，下面放一塊薄玻璃板，使用熱輻射刺激器 （天津BME-410C，伯爾尼科技有限公司） 距離玻璃板15 cm聚焦大鼠足底，大鼠縮足、揚(yáng)足或舔足等行為為陽性反應(yīng)，從刺激開始至出現(xiàn)陽性反應(yīng)時間為后足熱縮足反射潛伏期 （paw thermal withdrawal latency，PTWL），用它來表示熱痛閾值。刺激間隔時間＞15 min，反復(fù)測量3次，取平均值。為防止?fàn)C傷大鼠足部皮膚，設(shè)20 s為最高閾值。

1.5 Western blotting檢測

將大鼠麻醉后取右側(cè) L4和L5的DRG。蛋白上樣量為30 μg，使用12%濃度的分離膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜1 h到PVDF （4 ℃） 上，使用TBST沖洗3次，每次5 min，共15 min；接著用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h（室溫），然后用一抗MyD88抗體 （1 ∶500） 孵育過夜 （4 ℃），第2天TBST洗3次，每次15 min，之后使用二抗 （1 ∶1 000） 室溫孵育1 h，使用ECL發(fā)光液試劑盒檢測蛋白的表達(dá)。使用30 μg蛋白進(jìn)行ERK （1 ∶2 000） 和p-ERK （1 ∶1 000） 和β-actin抗體 （1 ∶2 000） 檢測。MyD88、ERK和p-ERK的蛋白條帶灰度值用Image J 軟件進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PMWT比較

結(jié)果顯示，CCI手術(shù)前大鼠對Von Frey絲刺激產(chǎn)生縮腿反應(yīng)的基線是13.6 g。與sham組比較，CCI組PMWT明顯降低 （P＜ 0.01），并具有時間依賴性。與CCI組比較，治療組PMWT術(shù)后1、3、5 d沒有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞ 0.05），而術(shù)后7、14 d時明顯升高 （P＜0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠PTWL比較

結(jié)果顯示，CCI手術(shù)前大鼠對熱刺激的縮腿反應(yīng)基礎(chǔ)閾值是 13 s。與sham組比較，CCI組PTWL明顯縮短 （P＜ 0.01），并具有時間依賴性。與CCI組比較，治療組PTWL明顯增加 （P＜ 0.01）。說明鞘內(nèi)注射蛇床子素能減弱CCI引起的熱痛覺過敏。見表2。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時間PMWT比較 （g）Tab.1 Comparison of PMWT in three rat groups after surgery （g）

表2 術(shù)后各組大鼠不同時間PTWL比較 （s）Tab.2 Comparison of PTWL in three rat groups after surgery （s）

2.3 各組大鼠DRG中MyD88、p-ERK的表達(dá)

結(jié)果顯示，術(shù)后14 d sham組大鼠DRG中的MyD88、p-ERK表達(dá)很低。與sham組比較，CCI組DRG中MyD88、p-ERK表達(dá)明顯增加 （P＜ 0.05）。與CCI組比較，治療組術(shù)后14dDRG中MyD88、p-ERK蛋白表達(dá)明顯減少 （P＜ 0.05），3組大鼠DRG中ERK 的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞ 0.05），見圖1、表3。

圖1 各組大鼠DRG中MyD88、p-ERK表達(dá)比較Fig.1 MyD88 and p-ERK expression in the DRG in each group

表3 各組大鼠DRG中MyD88、p-ERK的表達(dá)比較Tab.3 Comparison of MyD88 and p-ERK expression in three groups

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛具有自發(fā)性、痛覺過敏與超敏特征，目前有針對性的治療靶點(diǎn)仍未找到。CCI大鼠模型能夠激活MyD88依賴性信號通路，引起下游蛋白表達(dá)變化［5］。研究［6-7］證明通過硬膜外注射蛇床子素能抑制髓核致痛大鼠DRG中COX-2的表達(dá)。易智華等［8］研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素能通過下調(diào)DRG神經(jīng)元中P2X3R表達(dá)，減輕HIVgp120誘發(fā)的周圍神經(jīng)病理性疼痛。有研究［9］表明，蛇床子素通過抑制大鼠脊髓背角p38 MAPK信號相關(guān)通路，緩解髓核致炎癥神經(jīng)根痛 。還有研究［10］發(fā)現(xiàn)蛇床子素抑制大鼠DRG中CGRPR1蛋白的表達(dá)，緩解髓核致坐骨神經(jīng)痛。

本研究結(jié)果顯示蛇床子素抑制CCI大鼠DRG中MyD88和p-ERK的表達(dá)，可能機(jī)制是先通過抑制MyD88活化，影響下游信號通路ERK的磷酸化，進(jìn)而緩解CCI引起的機(jī)械痛和熱痛覺過敏。CCI大鼠模型會升高DRG中MyD88和p-ERK的表達(dá)，導(dǎo)致大鼠后足對機(jī)械痛和熱痛過敏［5］。蛇床子素通過干預(yù)MyD88和p-ERK的信號通路，緩解了大鼠后足對機(jī)械痛與熱痛過敏的情況。

蛇床子素具有多種藥理作用，而且毒性小，可以抑制NG08-15神經(jīng)元細(xì)胞的L型鈣離子電流內(nèi)流［11］。YANG等［12］研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素能夠通過抑制小鼠DRG神經(jīng)元對組胺和辣椒素的反應(yīng)，進(jìn)而減輕小鼠的瘙癢和疼痛。本研究為蛇床子素緩解疼痛的分子機(jī)制進(jìn)行了必要的補(bǔ)充，為更好開發(fā)蛇床子素的臨床鎮(zhèn)痛應(yīng)用提供有力證據(jù)。

綜上所述，蛇床子素可下調(diào)CCI大鼠DRG中MyD88、p-ERK的表達(dá)，減輕神經(jīng)病理性疼痛。本研究為神經(jīng)病理性疼痛治療提供了一個可能的作用靶點(diǎn)。