王曉楠，張勵(lì)，徐茜，楊旸，胡雪君

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110001）

阿爾茨海默病 （Alzheimer disease，AD） 是以漸進(jìn)性記憶和認(rèn)知功能受損為主要臨床癥狀的一種神經(jīng)退行性疾病。目前，AD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但在AD發(fā)病機(jī)制的諸多學(xué)說(shuō)中，神經(jīng)細(xì)胞外β淀粉樣蛋白 （β-amyloid，Aβ） 沉積處于主導(dǎo)地位［1］。AD的認(rèn)知功能障礙主要與神經(jīng)細(xì)胞能量代謝受損和氧化應(yīng)激 （活性氧產(chǎn)生） 等密切相關(guān)［2-3］。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+） 是氧化還原的輔酶，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)等多種生物學(xué)效應(yīng)［4］。NAD+的前體物質(zhì)煙酰胺單核苷酸 （nicotinamide mononucleotide，NMN） 可增加細(xì)胞內(nèi)NAD+水平。本研究采用AD大鼠模型，觀察NMN對(duì)認(rèn)知功能及海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞的影響，以期為AD的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量280～300 g （遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供）。大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，光照、通風(fēng)良好，溫度、濕度適宜，進(jìn)食、飲水自由。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，經(jīng)Morris水迷宮測(cè)試反應(yīng)正常，隨機(jī)分為假手術(shù)組、AD組和AD+NMN組，每組l2只。NMN和Aβ1-42均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 AD動(dòng)物模型建立及干預(yù)方法：給予大鼠3.6%水合氯醛 （1 mL/100 g） 腹腔注射麻醉。將大鼠頭部固定于腦立體定向儀，保持前后囟同一水平，切開(kāi)硬腦膜，選取海馬定位點(diǎn)，用微量注射器從腦表面垂直進(jìn)針，將1 μL Aβ1-42 （4 μg/μL） 在5 min內(nèi)緩慢注入，留針5 min，使Aβ1-42充分彌散，緩慢拔針，封補(bǔ)針孔，皮膚切口處用青霉素抗感染［5］。假手術(shù)組給予等體積的人工腦脊液。術(shù)后1 d大鼠完全清醒后，AD+NMN組每天給予腹膜注射NMN （500 mg/kg）干預(yù)治療，假手術(shù)組及AD組給予腹膜注射等滲生理鹽水注射液 （104.5 mg/kg），連續(xù)注射6周［6］。

1.2.2 認(rèn)知功能評(píng)價(jià)：末次給藥1 d后，采用Morris水迷宮評(píng)價(jià)大鼠認(rèn)知功能［7］。用染發(fā)劑將每只大鼠頭頸部毛發(fā)涂黑，進(jìn)行定位航行；測(cè)試時(shí)室溫為 （24±1）℃，將用熱水溶解的奶粉1 kg加入水迷宮中，加水使安全平臺(tái)低于水面1 cm，水溫維持在22 ℃。每次分別從4個(gè)不同象限進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將大鼠面朝池壁輕放入水中，記錄潛伏期 （從大鼠進(jìn)入水迷宮到爬上平臺(tái)時(shí)間）、誘導(dǎo)次數(shù) （如果大鼠120 s內(nèi)找不到平臺(tái)，可將其放回平臺(tái)） 等指標(biāo)。連續(xù)5 d行定位航行實(shí)驗(yàn)，4次/d，每次間隔20 min，于第6天撤除平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。每次3組平行進(jìn)行。

1.2.3 HE染色：常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋，利用HE染色法觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變［5］。

1.2.4 海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NAD+水平的測(cè)定：取出完整海馬組織并切片 （厚度400 μm），放入一個(gè)微孔的膜插件內(nèi)，解剖顯微鏡下調(diào)整海馬組織切片分布。將海馬組織切片搗碎溶解于75%乙醇-0.05 mol/L K2HPO4溶液，使NAD+在乙醇脫氫酶作用下轉(zhuǎn)換成NADH，13 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液，在400～600 nm分光光度計(jì)下測(cè)定NADH熒光值［7］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析及Scheffe法進(jìn)行多組間均數(shù)的比較，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

AD組大鼠逐漸出現(xiàn)行動(dòng)和反應(yīng)遲鈍，飲食減少，體質(zhì)量下降，一般狀態(tài)差；而AD+NMN組上述情況均較AD組大鼠有改善。

2.2 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組大鼠逃避潛伏期隨時(shí)間推移逐漸遞減。與假手術(shù)組比較，AD組逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）；與AD組比較，AD+NMN組逃避潛伏期顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，AD組象限活動(dòng)時(shí)間及穿越次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）；與AD組比較，AD+NMN組象限活動(dòng)時(shí)間及穿越次數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷程度比較

表1 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較 （，s）Tab.1 Escape latency in each group （，s）

表1 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較 （，s）Tab.1 Escape latency in each group （，s）

1） P ＜ 0.05 vs sham group；2） P ＜ 0.05 vs AD group.

表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)象限活動(dòng)時(shí)間和穿越次數(shù)比較 （）Tab.2 Time and number of crossing over a position platform （）

表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)象限活動(dòng)時(shí)間和穿越次數(shù)比較 （）Tab.2 Time and number of crossing over a position platform （）

1） P ＜ 0.05 vs sham group；2） P ＜ 0.05 vs AD group.

假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)正常；AD組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞體積腫脹或縮小，排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)致密，嗜酸性染色增強(qiáng)，白質(zhì)區(qū)組織疏松；AD+NMN組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)正常。見(jiàn)圖1。

2.5 海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NAD+水平

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HE染色 ×400Fig.1 HE staining in CA1 region of rats hippocampus ×400

與假手術(shù)組［（8.52±0.85） nmol/mg protein］比較，AD組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NAD+水平［（6.23±0.62）nmol/mg protein］顯著下降 （P＜ 0.05），而與AD+NMN組［（8.47±0.56） nmol/mg protein］則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。與AD組比較，AD+NMN組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NAD+水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。

3 討論

研究［1］發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)細(xì)胞外Aβ沉積有關(guān)?？扇苄訟β寡聚體在AD出現(xiàn)神經(jīng)變性前的早期記憶功能障礙中發(fā)揮了重要的作用［5］。Aβ寡聚體可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂，是致AD記憶損傷的上游因素，主要與氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞能量受損、線粒體功能障礙以及突觸傳遞功能抑制等密切相關(guān)［3，7］。本研究通過(guò)向大鼠海馬組織內(nèi)注射Aβ1-42寡聚體制作了AD動(dòng)物模型。

煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶是細(xì)胞內(nèi)NAD+合成的限速酶，可調(diào)控NAD+水平。神經(jīng)細(xì)胞可以通過(guò)煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)NAD+的生物合成，從而維持神經(jīng)細(xì)胞的正常形態(tài)及功能［8］。在DNA損傷時(shí)，多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1活性可被激活，通過(guò)水解NAD+及消耗ATP促進(jìn)DNA的修復(fù)。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1可被大量的活性氧激活，從而過(guò)度消耗ATP和NAD+，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，促進(jìn)AD發(fā)生［9-10］。NMN是NAD+的前體，而NAD+是電子轉(zhuǎn)移鏈中線粒體復(fù)合體Ⅰ的底物。NMN還可抑制多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1活性，增加細(xì)胞內(nèi)NAD+水平，從而改善多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡［11］。另一方面，NMN還可以通過(guò)直接抑制活性氧產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用［12］。

本研究中，AD組大鼠學(xué)習(xí)記憶水平明顯下降，表現(xiàn)為逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿越次數(shù)顯著減少，象限活動(dòng)時(shí)間顯著縮短；海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞死亡增加；神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NAD+水平明顯降低。給予NMN干預(yù)的AD+NMN組大鼠學(xué)習(xí)記憶水平較AD組明顯改善，表現(xiàn)為逃避潛伏期明顯縮短，穿越次數(shù)明顯增加，象限活動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)；海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞死亡減少；神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NAD+水平顯著升高，說(shuō)明NMN有效地改善了AD模型大鼠的認(rèn)知功能。

綜上所述，NMN可改善Aβ寡聚體誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而改善學(xué)習(xí)和記憶功能的損害，延緩AD進(jìn)展。推測(cè)NMN可能通過(guò)抑制多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1活性，增加細(xì)胞內(nèi)ATP生成，補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)NAD+水平，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，抗氧化作用可能是NMN神經(jīng)保護(hù)作用的上游機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。