穆陽杰，詹玉潔，許衛(wèi)鋒，夏天雨

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

土壤鹽堿化是全球旱作農(nóng)區(qū)最突出的生態(tài)環(huán)境問題，已成為影響糧食產(chǎn)量和糧食安全的重要限制因素[1]。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)/教科文組織（FAO/UNESCO）提供的數(shù)據(jù)（http://www.fao.org/ag/agl/agll/spush/intro.htm），全球約有8.3 億 hm2的土地受到鹽脅迫的威脅，其中約4.3 億hm2的土地為堿土。我國北方地區(qū)土壤含水量較低，土壤多呈堿性，不合理的地下水灌溉，加劇土壤的堿化[2]。目前植物耐鹽堿的研究主要集中于鹽脅迫上，而對堿脅迫特別是高 pH 的研究較少。研究表明，堿脅迫對植物的傷害較鹽脅迫更嚴重、更復(fù)雜[3]。因此，研究堿脅迫下相關(guān)基因的表達及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將是培育耐堿新品種和減少農(nóng)作物損失的重要途徑之一。

高 pH 會嚴重影響土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤的硝化作用[4]，還會打破植物細胞內(nèi)的電荷平衡和pH 內(nèi)穩(wěn)態(tài)，阻礙植物對水和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，造成滲透脅迫，誘導(dǎo)植物細胞產(chǎn)生活性氧，破壞細胞結(jié)構(gòu)完整性，最終破壞根的結(jié)構(gòu)和功能，抑制根發(fā)育[5-7]。因此，維持胞內(nèi)的pH 穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)根外pH 是植物抗堿的關(guān)鍵所在。植物調(diào)節(jié)胞內(nèi) pH 穩(wěn)態(tài)主要依賴于質(zhì)子泵H+-ATPase[8]。定位于質(zhì)膜上的H+-ATPase 將胞質(zhì)中的 H+運輸至細胞膜外；定位于液泡上的 V 型H+-ATPase 會將胞質(zhì)中的H+運輸至液泡內(nèi)；此外，質(zhì)子共轉(zhuǎn)運體或反向轉(zhuǎn)運體（H+-Symporter 和H+-Antiporter）也會改變胞質(zhì)內(nèi)的 pH[9-10]。蛋白激酶 PKS5（Salt overly sensitive 2-like protein kinase 5）是質(zhì)膜H+-ATPase 的負調(diào)控因子，pks5功能缺失突變體由于可以泵出更多的H+至胞外，從而表現(xiàn)出更加耐高pH 的表型[11]。

近幾年，研究人員利用高通量測序技術(shù)細致研究了小麥、水稻以及大豆等在堿脅迫（高濃度NaHCO3處理）條件下的轉(zhuǎn)錄表達譜[12-14]。然而，高pH 脅迫下植物的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答機制，仍然知之甚少。本研究旨在對植物耐堿機制進行初步研究，通過本實驗室建立的 pH 表型觀察系統(tǒng)，結(jié)合新一代高通量測序手段-轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq），以期獲得高pH 脅迫響應(yīng)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為植物耐堿分子機理的研究以及耐堿品種的培育提供強有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗所用擬南芥（Arabidopsis thaliana）為哥倫比亞（Col-0）生態(tài)型，為本實驗室保存的種子。

1.2 基于固體培養(yǎng)基的pH 實驗體系

預(yù)培養(yǎng)基的配制：稱取0.866 g MS（Murashige& Skoog，Caisson labs 公司），4 g 蔗糖（Sigma-Aldrich公司），加入超純水完全溶解后，定容至400 mL，NaOH 調(diào)節(jié)pH 至6.0，隨后加入 3.2 g 瓊脂（Sigma-Aldrich 公司）搖勻，高壓滅菌。培養(yǎng)基冷卻至55℃，超凈工作臺內(nèi)于滅菌方皿（10 cm × 10 cm）中加入培養(yǎng)基50 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

對照培養(yǎng)基的配制：稱取0.866 g MS（Murashige& Skoog，Caisson labs 公司），加入超純水完全溶解后，定容至400 mL，NaOH 調(diào)節(jié)pH 至6.0，隨后加入3.2 g 瓊脂（Sigma-Aldrich 公司）搖勻，高壓滅菌。培養(yǎng)基冷卻至55℃，超凈工作臺內(nèi)于滅菌方皿（10 cm × 10 cm）中加入培養(yǎng)基50 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

高pH 培養(yǎng)基的配制：稱取0.866 g MS（Murashige& Skoog，Caisson labs 公司），加入超純水完全溶解后，定容至400 mL，NaOH 調(diào)節(jié)pH 至8.0，隨后加入3.2 g 瓊脂（Sigma-Aldrich 公司）搖勻，高壓滅菌。培養(yǎng)基冷卻至55℃，超凈工作臺內(nèi)于滅菌方皿（10 cm × 10 cm）中加入培養(yǎng)基50 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

以上培養(yǎng)基滅菌采用濕熱滅菌法，于全自動高壓鍋（MLS-3781L，松下，日本）中 121℃滅菌 20 min。

高pH 脅迫處理：擬南芥Col-0 種子氯氣法滅菌后，播種至預(yù)培養(yǎng)基上[1/2 MS，1%（w/v）蔗糖，0.8%（w/v）瓊脂，pH 6.0]；4℃黑暗春化2 d，隨后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱繼續(xù)生長5 d；挑選長勢一致的幼苗分別轉(zhuǎn)移至對照培養(yǎng)基[1/2 MS，0.8%（w/v）瓊脂，pH 6.0]和高pH 培養(yǎng)基[1/2 MS，0.8%（w/v）瓊脂，pH 8.0]，光照培養(yǎng)箱內(nèi)生長7 d，觀察表型、統(tǒng)計根長或取根部組織進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。培養(yǎng)條件：14 h 光照/10 h 黑暗，濕度60%～70%，溫度23℃/21℃。

1.3 RNA 提取、質(zhì)控和建庫

RNA 提取與質(zhì)控：稱取對照培養(yǎng)基和高pH 培養(yǎng)基上處理7 d 的擬南芥根組織0.1 g，TRIzol 法提取組織總RNA[15]，每個處理組三個生物學(xué)重復(fù)。隨后用瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計（Nanophotometer N60，德國 IMPLEN 公司）檢測 RNA 濃度和OD260/OD280、OD260/OD230的比值。

建庫：將符合標準的RNA 利用Oligo dT 的磁珠對 mRNA 進行富集，加入片段化緩沖液（Fragmentation buffer）將富集的mRNA 片段化；用隨機引物反轉(zhuǎn)合成第一條cDNA 鏈，隨后加入緩沖液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成第二條cDNA 鏈；利用核酸純化試劑盒（AMPure XP beads，Beckman 公司）純化雙鏈cDNA，再進行末端修復(fù)、加A 并連接測序接頭，經(jīng)片段大小選擇后（300～400 bp），PCR 富集獲得 cDNA 測序文庫，華大測序平臺（BGISEQ）完成測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基因表達量的計算：將測序得到的原始數(shù)據(jù)（Raw data）進行數(shù)據(jù)過濾（去除測序接頭、重復(fù)冗余序列以及低質(zhì)量的序列），獲得高質(zhì)量的干凈數(shù)據(jù)（Clean data）。利用軟件TopHat2 將各個樣品的干凈數(shù)據(jù)（Clean data）與擬南芥參考基因組進行比對，并計算獲得各個基因的片段數(shù)（Reads count）以及每百萬轉(zhuǎn)錄本的每百萬個映射片段碎片 FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped fragments）值。

差異基因表達的篩選：通過使用 DESeq 自帶的標準化方法對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理。使用負二項分布法對片段數(shù)（Reads count）的分布進行估計，計算完P(guān)值后，對P值進行多重假設(shè)檢驗校正。差異基因篩選標準為：| log2（差異倍數(shù)，F(xiàn)old Change）| ＞ 1 且校正的P值（Padj）＜ 0.001。

GO 基因功能注釋分析：利用 https://www.Arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp 網(wǎng)站在線工具，對差異表達基因進行基因本體論 GO（Gene ontology）注釋和功能分類。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析：利用 Biomart 網(wǎng)站獲取 GO 亞分類中運輸（Transport）、細胞組分組成（Cellular component organization）、蛋白質(zhì)代謝（Protein metabolism）、根發(fā)育（Root development）、信號傳導(dǎo)（Signal transduction）和應(yīng)答非生物刺激（Response to abiotic stimulus）相關(guān)差異表達基因上游約1 kb 的啟動子序列。使用植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控預(yù)測網(wǎng)站http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/對上述啟動子序列與差異表達轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系進行預(yù)測，Cytoscape 軟件繪制轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 pH 實驗體系的確立

為研究高 pH 脅迫對植物發(fā)育的影響，首先確立了 pH 表型觀察系統(tǒng)。綜合前人研究[16]與前期實驗摸索，基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇1/2 MS 培養(yǎng)基，pH 調(diào)節(jié)劑選擇 NaOH，凝固劑選擇瓊脂。滅菌的擬南芥種子 4℃黑暗春化后，在添加 1%（w/v）蔗糖、初始pH（添加瓊脂和滅菌前的培養(yǎng)基pH）為6.0 的預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng) 5 d，轉(zhuǎn)移至不添加蔗糖、初始 pH 6.0的對照培養(yǎng)基以及初始pH 8.0 的高pH 培養(yǎng)基繼續(xù)光照培養(yǎng)7 d，觀察表型以及統(tǒng)計該七天主根的伸長長度（圖1）。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，不同實驗批次或者同一批次相同條件的不同培養(yǎng)皿之間表型有時會存在較大變異，猜測可能與每次配制培養(yǎng)基體積以及每個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基體積存在差異有關(guān)。因此，本研究固定了培養(yǎng)基的配制體系，即單次培養(yǎng)基配制體積為400 mL，每皿（10 cm × 10 cm）培養(yǎng)基的體積為50 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。圖2 表示萌發(fā)后五天的擬南芥幼苗經(jīng)對照（pH 6.0）和高pH（pH 8.0）培養(yǎng)基處理七天后的表型圖（圖 2a））和主根伸長長度統(tǒng)計圖（圖2b））。從圖中可以看出，高pH 脅迫下，擬南芥主根生長發(fā)育受到顯著抑制，導(dǎo)致主根長度顯著短于對照組。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量評價

為確定高pH 脅迫對擬南芥根轉(zhuǎn)錄水平的影響，將萌發(fā)后五天的擬南芥幼苗經(jīng)對照（pH 6.0）和高pH（pH 8.0）培養(yǎng)基處理七天，分別取擬南芥總根進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，每組三個生物學(xué)重復(fù)。對照組和高pH 處理組測序的原始序列均為21.94 M；過濾掉接頭和低質(zhì)量的序列，對照組干凈序列為21.86 M、21.87 M、21.87 M，高pH 處理組干凈序列為21.87 M、21.86 M、21.88 M；經(jīng)序列拼接比對到參考基因組，其比對率分別為 98.26%、98.3%、98.3%、98.28%、98.26%、98.27%（表 1）。以上數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高，符合進一步生物信息學(xué)分析。

2.3 高pH 脅迫下擬南芥根部差異表達基因的篩選

圖1 pH 實驗體系的建立Fig. 1 Establishment of a pH experiment system

表1 各個樣品轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Statistics of RNA-seq data of samples

利用DESeq 軟件包對對照組和高pH 處理組的基因進行差異表達分析，以差異表達倍數(shù)大于兩倍或小于 0.5 倍即|log2（差異倍數(shù)Fold Change）| ＞ 1和校正的P＜ 0.001 為標準，共篩選獲得根部差異表達基因1 129 個，其中800 個基因表達下調(diào)，329 個基因表達上調(diào)（圖 3a））。這表明高 pH 脅迫下，擬南芥根下調(diào)的基因顯著多于上調(diào)的基因。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在基因表達中起著至關(guān)重要的作用，本研究著重分析了高 pH 脅迫下差異表達的轉(zhuǎn)錄因子。如圖3b）所示，相比對照組，高pH 脅迫處理后22個轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)，75 個轉(zhuǎn)錄因子表達下調(diào)。將差異表達轉(zhuǎn)錄因子按照轉(zhuǎn)錄因子家族分類發(fā)現(xiàn)，有些轉(zhuǎn)錄因子家族bHLH（basic Helix-Loop-Helix）、CO-like（CONSTANS-like）、YABBY 等僅存在表達上調(diào)的基因，如YABBY 家族中3 個成員表達上調(diào)，無表達下調(diào)的基因；有些轉(zhuǎn)錄因子家族NAC、C2H2、HSF（Heat stress transcription factors）等僅具有表達下調(diào)的基因，如NAC 家族中6 個成員表達下調(diào)，無表達上調(diào)的基因；有些轉(zhuǎn)錄因子家族AP2-EREBP、MYB、WRKY 等既有表達上調(diào)也有表達下調(diào)的基因，如 AP2-EREBP 家族中 17 個成員表達下調(diào)，2個成員表達上調(diào)（圖3c））。

2.4 差異表達基因的GO 功能注釋與分類

為了確定高 pH 脅迫響應(yīng)基因的功能，對差異表達基因進行GO 功能注釋。如圖4a）所示，在GO類目生物學(xué)過程中，注釋分類到非生物脅迫應(yīng)答、發(fā)育過程、轉(zhuǎn)錄、細胞組織和生物發(fā)生、轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等 GO 亞類目中的差異表達基因所占比例較高；在GO 類目分子功能中（圖 4b）），差異表達基因主要分類到蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)運蛋白活性以及激酶活性等GO 亞類目中；在GO 類目細胞組分中（圖 4c）），差異表達基因主要分布在胞外組分、細胞膜、線粒體、細胞質(zhì)和質(zhì)體等部位。以上結(jié)果表明，高 pH 脅迫會導(dǎo)致擬南芥根部基因轉(zhuǎn)錄、離子運輸、細胞組織與發(fā)生、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育等過程發(fā)生顯著變化。下面，本研究將對這些生物學(xué)過程的基因進行更加細致的分析。

2.5 高pH 脅迫應(yīng)答通路中重要基因的鑒定

離子運輸是維持細胞內(nèi) pH 穩(wěn)態(tài)的一個重要因素，也是植物應(yīng)答高pH 脅迫的重要途徑[8]。GO 功能注釋顯示，約51 個差異表達基因被分類到GO 亞類目（GO：0006811）離子運輸中，其中，編碼鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白的基因SKOR、編碼陰離子/質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白的基因CHX20和編碼鋅離子轉(zhuǎn)運蛋白的基因ZIP5的表達在高pH 脅迫下顯著上調(diào)，而編碼硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的基因SULTR1；1、SULTR2；1和SULTR3；1以及編碼轉(zhuǎn)運蛋白的基因BOR5的表達在高pH 脅迫下顯著下調(diào)（圖5a））。這表明，擬南芥根部編碼 K+、Zn2+、Ca2+以及轉(zhuǎn)運蛋白的基因參與了擬南芥高pH 脅迫響應(yīng)。

圖4 高pH 脅迫下根組織差異表達基因的基因本體論（GO）功能注釋（a）生物學(xué)過程，b）分子功能，c）細胞組分）Fig. 4 Gene ontology（GO）functional annotation of differentially expressed genes under high pH condition（a）Biological process，b）Molecular function，c）Cellular component）

細胞內(nèi)外 pH 的變化對于細胞壁的合成起著至關(guān)重要的作用。GO 功能注釋顯示，約48 個基因被分類到GO 亞類目細胞壁組織和生物發(fā)生過程（GO：0071554）。在高 pH 脅迫下，編碼擴張蛋白的基因EXPA17表達上調(diào)，而EXPA6、EXPA8、EXPB2和EXLA3等基因表達下調(diào)，編碼纖維素合成酶的基因CSLG1表達下調(diào)（圖5b））。此外，編碼果膠裂解酶的基因表達量在高pH 脅迫下也發(fā)生了顯著變化（圖5b））。這表明高 pH 脅迫會對擬南芥根細胞壁形成造成傷害。

Ca2+作為第二信使在許多植物發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[17]。不同刺激下細胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)變化與胞內(nèi) pH 的變化存在緊密聯(lián)系[18]。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，編碼鈣調(diào)蛋白的基因CML23、CML37和CML38在高pH 脅迫下表達量顯著降低（圖5c））。這表明，高 pH 脅迫會減弱細胞內(nèi)的 Ca2+信號傳遞水平。此外，高pH 脅迫還會影響植物激素合成運輸以及信號傳遞相關(guān)基因的表達，本研究共篩選出10 個差異表達的生長素合成、運輸和信號傳遞相關(guān)基因以及 5 個細胞分裂素合成與代謝相關(guān)基因（圖 5d））。

2.6 高pH 脅迫轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用，本研究結(jié)果顯示高 pH 脅迫下差異表達的轉(zhuǎn)錄因子占總差異表達基因的8.6%。利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系預(yù)測網(wǎng)站，對參與高 pH 脅迫響應(yīng)的非生物脅迫應(yīng)答（GO：0009628）、細胞組分組織（GO：0016043）、蛋白質(zhì)代謝（GO：0019538）、根發(fā)育（GO：0048364）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（GO：0007165）和轉(zhuǎn)運（GO：0006810）等生物學(xué)過程相關(guān)基因與差異表達的轉(zhuǎn)錄因子之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系進行了預(yù)測。

根據(jù)預(yù)測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)約有33 個差異表達轉(zhuǎn)錄因子與高pH 脅迫響應(yīng)基因存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系，且大部分轉(zhuǎn)錄因子在高pH 脅迫下表達量顯著下調(diào)（圖6）。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子家族分類，CBF1、CBF2、DDF1、DREB1A、RRTF1 等 14 個 AP2/EREBP 家族成員與高pH 脅迫應(yīng)答基因存在密切調(diào)控關(guān)系；WRKY 家族 WRKY8、WRKY24、WRKY43、WRKY45、WRKY46 和WRKY71 等六個成員可能調(diào)控高pH 脅迫響應(yīng)基因的表達；NAC011、NAC042、NAC045、NAC071 和 CUC3 等 5 個 NAC 轉(zhuǎn)錄因子以及MYB15、MYB17、MYB27、MYB77 和 MYB107 等5 個MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族也與高pH 脅迫響應(yīng)基因存在密切調(diào)控關(guān)系（圖 6）。此外，參與不同生物學(xué)過程的高pH 脅迫響應(yīng)基因具有的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控位點也可能存在差異。例如，編碼細胞壁纖維素合成關(guān)鍵酶的基因CSLG1的啟動子區(qū)存在AP2/EREBP 和NAC家族成員的結(jié)合位點；生長素信號響應(yīng)基因SAUR40的啟動子區(qū)主要具有WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控位點；而陰離子/質(zhì)子轉(zhuǎn)運基因CHX20啟動子區(qū)僅存在DREB1A 和DREB4A 的結(jié)合位點（圖6）。

3 討 論

3.1 高 pH 脅迫引起離子穩(wěn)態(tài)失衡、細胞壁合成障礙以及Ca2+信號異常

堿脅迫由于其高 pH 通常對植物的生長抑制效應(yīng)遠大于鹽脅迫[19]。高 pH 處理下，擬南芥的根生長受到抑制，這種抑制可能與細胞壁酸性環(huán)境缺失、離子穩(wěn)態(tài)失衡、活性氧積累、細胞壁完整性破壞、蛋白質(zhì)變性等密切相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，高pH脅迫處理七天后，離子轉(zhuǎn)運基因的表達量發(fā)生了顯著變化，如負責銅離子、硫酸鹽離子、硝酸鹽離子、鉀離子、硼離子、碳酸氫根離子和鋁離子等轉(zhuǎn)運的基因均參與高 pH 脅迫應(yīng)答（圖 5a））。研究表明，細胞質(zhì)中低Na+高K+水平是許多酶促反應(yīng)維持所必須的，在堿脅迫下水稻根細胞中 Na+積累異常，而K+、Cl-水平會顯著下降，從而產(chǎn)生離子毒害抑制水稻根的發(fā)育[5]。本研究也發(fā)現(xiàn)，編碼 K+離子通道的基因HAK5以及離子通道的基因NRT1.7的表達量在高 pH 脅迫下顯著下降（圖5a））。進一步，轉(zhuǎn)錄調(diào)控預(yù)測分析表明，HAK5和NRT1.7基因啟動子區(qū)分別具有MYB15 和NAC011轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。NAC 和MYB 家族成員參與多種非生物脅迫響應(yīng)過程[21-22]，高 pH 脅迫下MYB15和NAC011基因的表達也顯著降低，暗示兩者可能通過調(diào)控離子轉(zhuǎn)運基因維持離子穩(wěn)態(tài)來參與高 pH的脅迫應(yīng)答過程。

植物細胞的細胞壁是由纖維素和果膠組成，其中還包含一些其他酶類如伸展蛋白和擴張蛋白等[23]。細胞壁組成相關(guān)基因的異常會改變植物對非生物脅迫的抗性[23]，例如，擬南芥果膠合成基因AtCSLD5功能缺失突變體sos6（Salt overly sensitive 6）表現(xiàn)出滲透、鹽和干旱脅迫敏感的表型[24]。本研究結(jié)果表明，高pH 脅迫下編碼纖維素合成酶的基因CSLG1和編碼擴張蛋白的基因EXPA6和EXPA8的表達量顯著降低（圖5b）），這可能是擬南芥根生長受到抑制的原因之一。轉(zhuǎn)錄調(diào)控預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，CSLG1啟動子區(qū)存在多個AP2/EREBP 和NAC 類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，他們的表達量均發(fā)生顯著下調(diào)。這暗示提高相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達量可能會提高植物對高 pH的耐受性。

研究表明，Ca2+信號以及植物激素在非生物脅迫應(yīng)答過程中起著重要作用[25]。Yang 等[26]發(fā)現(xiàn)鈣離子感受器 SCaBP3/CBL7 一方面可以與質(zhì)膜質(zhì)子泵AHA2 的C 末端互作，促進AHA2 的自抑制，另一方面還可以與 PKS5 互作，穩(wěn)定 PKS5 與 AHA2 的相互作用，進而促進PKS5 對AHA2 的抑制，調(diào)控胞內(nèi)pH 穩(wěn)態(tài)。此外，大豆GsCML27 作為Ca2+結(jié)合蛋白在植物對堿脅迫、鹽脅迫和滲透脅迫的反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用[27]。同樣地，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)高 pH 脅迫會導(dǎo)致 Ca2+信號組分相關(guān)基因表達顯著降低，如編碼鈣調(diào)蛋白的基因CML23、CML37、CML38和編碼TSK 相關(guān)蛋白的基因TSA1等（圖5c））。因此，調(diào)控 Ca2+信號組分的表達水平也是植物響應(yīng)高 pH脅迫的主要途徑之一。

3.2 AP2/EREBP、WRKY、MYB 以及 NAC 等轉(zhuǎn)錄因子在高 pH 脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用

轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物代謝與發(fā)育相關(guān)基因的表達，且在環(huán)境脅迫應(yīng)答等過程中具有重要作用。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在鹽堿脅迫應(yīng)答中也具有重要作用。An 等[28]通過對鹽堿處理1 d 和7 d 的紫花苜蓿的幼苗進行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，109 個轉(zhuǎn)錄因子在鹽堿處理1 d 后表達發(fā)生顯著變化，而96 個轉(zhuǎn)錄因子在鹽堿處理7 d 后表達發(fā)生顯著變化，其中它們大多數(shù)屬于非生物脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子家族，例如MYB、WRKY、NAC、AP2/EREBP、bHLH 和bZIP等。同樣地，2018 年 Li 等[13]通過轉(zhuǎn)錄組分析的方法比較了水稻耐堿品種 WD20342 和堿敏感品種Caidao 在正常和堿脅迫處理下的差異表達基因，經(jīng)差異表達分析發(fā)現(xiàn)，一共有576 個轉(zhuǎn)錄因子的表達存在差異，這些轉(zhuǎn)錄因子分別屬于MYB、WRKY、NAC、AP2-EREBP、bHLH 和 bZIP 等 69 個轉(zhuǎn)錄因子家族。與以上研究結(jié)果一致，本研究的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果同樣證實，高 pH 脅迫處理七天后擬南芥根部一共有97 個轉(zhuǎn)錄因子的表達發(fā)生了顯著變化，它們分別屬于AP2-EREBP、MYB、WRKY、MADS、NAC、bHLH 等轉(zhuǎn)錄因子家族（圖3b）和圖3c））。

進一步地，本研究對差異表達轉(zhuǎn)錄因子與堿脅迫應(yīng)答關(guān)鍵基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進行了預(yù)測，結(jié)果證實14 個AP2/EREBP 家族成員、6 個WRKY家族成員、5 個NAC 家族成員和5 個MYB 家族成員與堿脅迫應(yīng)答關(guān)鍵基因如離子運輸、蛋白質(zhì)代謝以及非生物脅迫應(yīng)答等相關(guān)基因存在著密切的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系（圖6）。這些轉(zhuǎn)錄因子大多在非生物脅迫應(yīng)答過程起著重要的作用。例如，AP2/EREBP 家族成員CBF1和CBF2主要參與植物抗凍脅迫[29]；DREB1A參與干旱和低溫脅迫應(yīng)答[30]；WRKY 家族成員WKRY8、WRKY46和STZ參與擬南芥鹽脅迫應(yīng)答[31-33]；此外，過表達擬南芥RRTF1會導(dǎo)致根與莖中活性氧的積累[34]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，高pH脅迫響應(yīng)基因啟動子區(qū)存在上述轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，且它們的表達也會受到高 pH 的影響，暗示它們在高 pH 脅迫應(yīng)答中也具有重要的作用。因此，CBF1、DREB1A 以及 RRTF1 等轉(zhuǎn)錄因子可以作為耐堿品種培育的關(guān)鍵候選基因進行深入研究。

4 結(jié) 論

本研究通過前期建立的 pH 表型觀察系統(tǒng)，結(jié)合高通 RNA-seq 技術(shù)將對照組（pH 6.0）和高 pH處理組（pH 8.0）的擬南芥根部進行了轉(zhuǎn)錄組測序。分析了高pH 脅迫下擬南芥根的差異表達基因，GO功能注釋表明轉(zhuǎn)錄、離子運輸、細胞組織與發(fā)生、蛋白質(zhì)代謝、發(fā)育過程、非生物脅迫應(yīng)答以及信號傳遞等生物學(xué)過程相關(guān)基因受到高pH 脅迫的影響。關(guān)鍵基因分析表明，擬南芥通過改變離子運輸、Ca2+信號和植物激素信號等相關(guān)基因的表達參與高 pH脅迫應(yīng)答。轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測證明 AP2/ERBEP、MYB、WRKY 以及NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子可能在高pH脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄變化中起著核心作用。該研究為進一步探討擬南芥高 pH 脅迫應(yīng)答與耐堿品種的培育奠定了理論基礎(chǔ)。