廖暉，徐小平，周陳杰，張健民，鐘克波，楊定華

1南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院肝膽二科，廣州 510280；2南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院肝膽外科，廣州 510515

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康和生命安全[1]。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2008年全球范圍內(nèi)約有74.83萬肝癌新發(fā)病例，約有69.59萬人死于肝癌，其中新發(fā)病例和死亡病例中約50%來自中國[2]。我國肝癌發(fā)病率和病死率分別位居所有惡性腫瘤的第4位和第2位[3]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian/mechanistic target of rapamycin，mTOR)是一種在進化中高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可在多種因素的活化下參與細胞增殖、凋亡和自噬等生物學過程[4-5]。mTOR可與其他蛋白相結(jié)合形成兩種不同形式的復合物，即mTOR復合物1(mTORC1)和mTOR復合物2 (mTORC2)。近年來，自噬在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用引起了廣泛關(guān)注。自噬既是細胞的一種自我保護機制，也是一種與凋亡、壞死并列的細胞程序性死亡機制[6-7]。mTOR信號通路是調(diào)控細胞自噬最重要的信號通路之一[8]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，雙mTORC1/2抑制劑AZD2014可誘導肝癌細胞產(chǎn)生自噬[9]，但AZD2014誘導產(chǎn)生的自噬在HCC分子靶向治療中的作用(抗癌還是促癌)尚未明確。本研究使用雙mTORC1/2抑制劑AZD2014處理人肝癌細胞株HCCLM3，旨在探討AZD2014誘導的自噬對肝癌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人肝癌細胞株HCCLM3購自中國科學院上海細胞庫。AZD2014(雙mTOR抑制劑)、雷帕鳴(單mTOR抑制劑)、3-甲基腺嘌呤(3-MA，自噬抑制劑)均購自美國Selleckchem公司；0.5% Trypsin-EDTA消化酶液購自美國Gibco公司；胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所；單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)購自美國Sigma公司；LC3B單克隆一抗、Beclin-1單克隆一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin單克隆一抗、HRP標記的羊抗兔和鼠二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。細胞超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自德國Thermo Sientific公司；低速離心機購自上海安亭科學儀器廠；倒置相差顯微鏡、普通正置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡均購自日本Olympus公司；自動雙重純水蒸餾器購自美國Millipore公司；ELX800多功能酶標儀購自美國Bio-Tek公司；PowerPace Basic基礎(chǔ)電源、MiniTrans-Blot 3電轉(zhuǎn)槽、Mini-PROTEAN 3垂直電泳系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司；GeneGnome HR化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自英國Synoptics公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理 用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、含5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肝癌細胞株HCCLM3。培養(yǎng)過程中，根據(jù)實驗需要加入AZD2014、雷帕鳴或3-MA，濃度參考本課題組的既往研究，終濃度分別為100 nmol/L、100 nmol/L和10 mmol/L[9]。

1.3 MDC染色檢測HCCLM3肝癌細胞中自噬囊泡的變化 在12孔板中加入少量培養(yǎng)液，然后加入圓形細胞爬片，使細胞爬片貼附于孔底，將混勻的HCCLM3肝癌細胞懸液滴入培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，根據(jù)實驗分組(分為對照組、雷帕鳴組、AZD2014組、3-MA組、雷帕鳴+3MA組和AZD2014+3-MA組)加入相應(yīng)藥物進行干預(yù)。培養(yǎng)48 h后吸除培養(yǎng)基，加入0.05 mmol/L MDC工作液，每孔800 μl，避光孵育10 min，37 ℃ PBS溶液洗滌4次。將細胞爬片倒扣于滴有防熒光淬滅封片劑的載玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察和拍照(鏡下呈藍光，激發(fā)光波長為358 nm，發(fā)射光波長為461 nm)。

1.4 Western blotting檢測HCCLM3肝癌細胞自噬相關(guān)蛋白的表達 將人肝癌細胞株HCCLM3接種于6孔板，待細胞生長至70%～80%融合時，根據(jù)實驗分組(分為對照組、雷帕鳴組和AZD2014組)加入相應(yīng)藥物進行干預(yù)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用預(yù)冷的PBS清洗細胞2次，加入適量RIPA裂解液(含有蛋白酶抑制劑)，冰上裂解5 min，4 ℃下15 000 r/min離心20 min，上清液即為細胞總蛋白提取液。采用BCA法測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，100 ℃沸水浴10 min，使蛋白樣品充分變性。取30 mg蛋白行SDS-PAGE電泳(電泳條件：恒壓電泳，電壓70 V、時間30 min；轉(zhuǎn)為電壓100 V、時間105 min)，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(轉(zhuǎn)膜條件：恒流電泳，電流250 mA、時間90 min)。用含5% BSA的TBST溶液封閉1 h，TBST溶液清洗后，將PVDF膜浸泡于一抗(1:1000)中，4 ℃搖床孵育過夜，TBST溶液清洗3次，然后浸泡于二抗(1:4000)中，室溫下?lián)u床孵育1 h，TBST溶液清洗3次。采用電化學發(fā)光法顯影，應(yīng)用GeneGnome HR化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，Image J 軟件分析，所得灰度值即為蛋白相對表達量。

1.5 CCK-8法檢測HCCLM3肝癌細胞的增殖 將人肝癌細胞株HCCLM3接種于96孔板，100 μl/孔(約5×103個細胞)，待細胞貼壁后，根據(jù)實驗分組(分為對照組、3-MA組、AZD2014組和AZD2014+3-MA組)加入相應(yīng)藥物進行干預(yù)。然后置于37 ℃、含5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每36 h換液一次(補充新的培養(yǎng)基及藥物)。分別于12、24、36、48、60、72 h換液后加入CCK-8試劑，每孔10 μl，同時設(shè)置4個調(diào)零孔(僅含完全培養(yǎng)基，不含有細胞)，培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度(OD)值。OD值=實驗組OD值-調(diào)零孔OD值。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，假設(shè)檢驗采用雙側(cè)檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 AZD2014對HCCLM3肝癌細胞自噬的影響 MDC染色顯示，與對照組比較，AZD2014處理后，HCCLM3肝癌細胞中MDC染色囊泡數(shù)量較多、體積較大；加入自噬抑制劑3-M A 后，AZD2014誘導的HCCLM3肝癌細胞中MDC染色囊泡數(shù)量明顯減少(圖1)。

2.2 AZD2014對HCCLM3肝癌細胞自噬相關(guān)蛋白的影響 Western bloはing檢測結(jié)果顯示，AZD2014處理后，HCCLM3肝癌細胞中自噬標記蛋白LC3B-Ⅱ、 Beclin-1的表達水平明顯高于對照組和雷帕鳴組 (P＜0.05，圖2)。該結(jié)果與MDC染色結(jié)果相互印證。

圖1 MDC染色檢測AZD2014對HCCLM3肝癌細胞自噬的影響Fig.1 Effect of AZD2014 on autophagy of hepatoma HCCLM3 cells (MDC staining)

圖2 AZD2014對HCCLM3肝癌細胞自噬相關(guān)蛋白的影響(Western blotting，n=3)Fig.2 Expressions of LC3B and Beclin-1 in hepatoma HCCLM3 cells treated with AZD2014 (Western blotting, n=3)

2.3 AZD2014誘導的自噬對HCCLM3肝癌細胞增殖的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，AZD2014可明顯抑制HCCLM3肝癌細胞的增殖(P＜0.05)。加入3-MA抑制自噬后，可部分逆轉(zhuǎn)AZD2014對HCCLM3肝癌細胞增殖的抑制作用(圖3)。

3 討 論

近年來自噬已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR信號通路可誘導細胞產(chǎn)生自噬，而傳統(tǒng)的mTORC1抑制劑雷帕鳴是目前研究中最常用的自噬誘導劑之一[10-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雷帕鳴僅可誘導部分細胞產(chǎn)生自噬，并不是一種理想的肝癌細胞自噬誘導劑，而AZD2014能夠成功誘導所有肝癌細胞株(本課題組既往研究中所選的所有細胞株)產(chǎn)生自噬，這一現(xiàn)象在其他課題組和其他類型細胞中亦有類似報道[9,12-13]。但有關(guān)自噬在腫瘤治療中的作用尚未明確，有研究認為自噬有利于腫瘤治療，也有研究認為自噬不利于腫瘤治療。

圖3 CCK-8法檢測AZD2014誘導的自噬對HCCLM3肝癌細胞增殖的影響(n=3)Fig.3 Effect of AZD2014 on cell proliferation in hepatoma HCCLM3 cells detected by CCK-8 (n=3)

根據(jù)2012年《自噬研究與分析解釋指南》，MDC染色法必須與自噬抑制劑聯(lián)合應(yīng)用才可用于檢測自噬現(xiàn)象，即只在MDC染色囊泡被自噬抑制劑(如3-MA)抑制的情況下，MDC染色囊泡才被認為是自噬囊泡[14]。因此，本研究在細胞培養(yǎng)過程中加入自噬抑制劑3-MA，結(jié)果顯示，3-MA可以抑制AZD2014誘導產(chǎn)生MDC染色囊泡，提示AZD2014可誘導HCCLM3肝癌細胞產(chǎn)生自噬。HCCLM3肝癌細胞中自噬標記蛋白LC3B-Ⅱ和Beclin-1表達水平的變化亦證實了這一現(xiàn)象。本研究采用AZD2014+3-MA同時處理肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)抑制自噬后可部分逆轉(zhuǎn)AZD2014對細胞增殖的抑制作用，提示AZD2014誘導產(chǎn)生的自噬具有抗癌作用，有利于腫瘤治療，但其具體分子機制尚未明確。

本課題組的既往研究發(fā)現(xiàn)，在部分HCC細胞中，單獨抑制mTORC1信號(雷帕鳴)不能誘導HCC細胞產(chǎn)生自噬，且該部分細胞對雷帕鳴耐藥；而同時抑制mTORC1和mTORC2信號(AZD2014)可誘導HCC細胞產(chǎn)生自噬，且這部分細胞對AZD2014較敏感[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞對雷帕鳴的耐藥性與S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，SKP2)的高表達有關(guān)[15]。最近研究發(fā)現(xiàn)，SKP2在自噬調(diào)控過程中起重要作用[16-17]，提示AZD2014可能通過SKP2調(diào)控細胞自噬進而影響肝癌細胞的增殖。

綜上所述，雙mTORC1/2抑制劑AZD2014可以通過誘導自噬抑制肝癌細胞增殖，為AZD2014在肝細胞癌分子靶向治療中的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但其具體作用機制尚未明確，有待進一步研究。