姚琦，周閣，戴建國，張璐瑤，胡榮魁

1南京中醫(yī)藥大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)系，南京 210023；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生殖科，南京 210023；3南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，南京 210023

自1988年我國首例試管嬰兒誕生以來，輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technologies，ART)子代正逐漸成為我國新生人口的一個重要組成部分[1]。大量流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，ART的核心技術(shù)——控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)引發(fā)的母體孕早期超生理的激素水平與胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)及低出生體重密切相關(guān)[2-5]。Hu等[4]的一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究顯示，鮮胚移植子代的出生體重較凍胚移植子代、自然妊娠子代明顯降低，且鮮胚移植子代低出生體重兒、小于胎齡兒的發(fā)生率較凍胚移植子代、自然妊娠子代明顯增高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在鮮胚移植單胎妊娠組，因COH引發(fā)的母體孕早期雌激素水平越高，子代發(fā)生低出生體重兒、小于胎齡兒的風(fēng)險(xiǎn)就越高。Farhi等[2]也發(fā)現(xiàn)，COH引發(fā)的母體孕早期雌激素水平越高，子代發(fā)生宮內(nèi)發(fā)育遲緩的風(fēng)險(xiǎn)越高。但COH引發(fā)的母體孕早期超生理激素水平影響胚胎生長發(fā)育的病理學(xué)機(jī)制目前尚不清楚。

妊娠期胎盤是聯(lián)系母體與胎兒的樞紐，胎兒在子宮內(nèi)能否正常生長發(fā)育取決于胎盤的功能，而目前仍不清楚COH引發(fā)的母體高激素水平是否會影響胎盤功能。因此，本研究通過建立COH引發(fā)母體孕早期高激素水平的小鼠模型，觀察孕18.5 d時的胚胎重量、胎盤重量及胎盤功能，探討COH影響小鼠胎盤功能的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 SPF級7～8周齡雌性昆明小鼠150只，體重26～32 g；8～10周齡雄性昆明小鼠40只，體重32～40 g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[許可證號SCXK(滬)2013-0006]。人輸卵管液(HTF)、簡單優(yōu)化培養(yǎng)液(KSOM)胚胎培養(yǎng)液(日本ARK-Resource公司)；人絨毛膜促性腺激素(HCG)、孕馬血清促性腺激素(PMSG，寧波第二激素廠)；TUNEL檢測試劑盒(德國Roche公司)；SNAT2抗體(美國Abcam公司)；β-actin抗體及二抗(美國Santa Cruz公司)；生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)。實(shí)驗(yàn)過程符合國家及單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物的管理及使用規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)扎雄性小鼠輸精管 取10只10周齡雄性小鼠，0.8%戊巴比妥鈉麻醉，輕壓腹腔，將兩側(cè)睪丸壓回陰囊，沿左側(cè)陰囊中線做一長約10 mm切口，在睪丸胞膜上做一長約5 mm切口，將輸精管牽引出來，將其燒烙掉1 cm左右，縫合手術(shù)切口。重復(fù)上述步驟處理另一側(cè)睪丸及輸精管。

1.2.2 體外受精(in vitrofertilization，IVF) 取供卵鼠20只，腹腔注射PMSG 10 U/只，46 h后腹腔注射HCG 10 U/只。13 h后，取卵丘復(fù)合物，加入獲能精子，置于HTF胚胎培養(yǎng)液中受精4～6 h，將受精卵移入KSOM胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)至囊胚。

1.2.3 假孕雌鼠的制備及胚胎移植 將性成熟雌性小鼠與輸精管結(jié)扎術(shù)后的雄性小鼠按2:1合籠，次日上午檢查雌鼠，見陰道栓者為假孕雌鼠，計(jì)為孕0.5 d。以此假孕雌鼠作為囊胚移植的受體鼠為自然交配假孕鼠(自然交配受體組)。將性成熟雌性小鼠腹腔注射PMSG 10 U/只，46 h后腹腔注射HCG 10 U/只，與輸精管結(jié)扎后的雄性小鼠合籠，次日上午檢查雌鼠，見陰道栓者為假孕雌鼠，計(jì)為孕0.5 d。以此假孕鼠作為囊胚移植的受體鼠為超促排后交配假孕鼠(超促排受體組)。以上兩組均在孕2.5 d于左側(cè)子宮角移植8～10枚囊胚(圖1)。

1.2.4 胎盤組織學(xué)分析 于孕18.5 d選取自然交配受體組、超促排受體組各6窩胎鼠中最接近平均體重胎鼠的胎盤，4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，顯微鏡下觀察胎盤組織病理學(xué)改變情況，辨別胎盤迷路層及連接層，用顯微圖像軟件cellSens software (version 1.8)測量胎盤迷路層及連接層 面積。

1.2.5 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)檢測胎盤細(xì)胞凋亡情況 胎盤組織石蠟切片脫蠟、水合，細(xì)胞通透，滴加TUNEL檢測液37 ℃孵育60 min，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗地高辛抗體37 ℃孵育30 min，DAB顯色。顯微鏡觀察，分別計(jì)數(shù)胎盤迷路層、胎盤連接層1300個細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/1300×100%。

圖1 IVF、胚胎移植、胚胎及胎盤收集流程圖Fig.1 Flow chart of IVF, embryo transplantation, collection of fetuses and placenta

1.2.6 胎盤組織中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量測定 于孕18.5 d選取自然交配受體組、超促排受體組各6窩胎鼠中最接近平均體重胎鼠的胎盤，于PBS中制備10%胎盤組織勻漿，取上清，巴比妥酸法測定胎盤組織中的MDA含量，分光光度計(jì)法測定胎盤組織中的GSH含量，Bradford法測定細(xì)胞蛋白濃度。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7 熒光實(shí)時定量PCR檢測胎盤Snat1、Snat2、Snat4、Lat1、Lat2、Cd98、Taut mRNA水平 于孕18.5 d選取自然交配受體組、超促排受體組各3窩胎鼠中最接近平均體重的3只胎鼠的胎盤，Trizol試劑提取各組胎盤組織的總RNA，取4 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Applied Biosystems StepOnePlusTM熒光實(shí)時定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各引物見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，35個循環(huán)。檢測熒光信號并分析循環(huán)閾值(Ct)，ΔCt為目的基因與內(nèi)參照GAPDH循環(huán)閾值的差值，ΔΔCt為超促排受體組與自然交配受體組ΔCt的差值，采用公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.8 胎盤微絨毛膜(microvillous membrane，MVM)提取 于孕18.5 d分別將自然交配受體組、超促排受體組各6窩胎鼠的胎盤合并，于BufferA(含250 mmol/L蔗糖，1 mmol/L乙二胺四乙酸，10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸-三異丙基乙磺酰，蛋白酶抑制劑混合物，pH值7.4)中勻漿。取上清，參照J(rèn)ansson等[6]報(bào)道的Mg2+沉淀法通過差速離心提取胎盤MVM。

表1 熒光實(shí)時定量PCR引物Tab.1 Primers used for real-time PCR

1.2.9 Western blotting檢測MVM中SNAT2蛋白水平 蛋白煮沸變性后，用10% SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%BSA的TBST室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光試劑ECL A液及B液檢測，IS2000R圖像工作站成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組的窩數(shù)、胚胎數(shù)、胚胎及胎盤重量比較 孕18.5 d，6只自然交配受體獲得37枚胚胎，6只超促排受體獲得29枚胚胎，胚胎均在左側(cè)子宮角獲得，提示胚胎均通過移植獲得。超促排受體組每窩胚胎數(shù)、胚胎重量及胎盤重量均低于自然交配受體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

2.2 兩組胎盤迷路層、連接層面積及細(xì)胞凋亡情況比較 兩組的胎盤未見明顯病理學(xué)改變(圖2)。兩組的胎盤迷路層面積、連接層面積、胎盤迷路層面積/總面積比值、胎盤連接層面積/總面積比值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。超促排受體組胎盤迷路層及連接層的細(xì)胞凋亡率均明顯高于自然交配受體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3、表3)。

2.3 兩組胎盤組織中GSH、DMA含量比較 與自然交配受體組比較，超促排受體組胎盤組織中抗氧化物質(zhì)GSH含量明顯降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。2.4 兩組胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)水平比較 與自然交配受體組(1.00±0.00)相比，超促排受體組的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體Snat1、Snat2、Lat2、Taut mRNA表達(dá)水平明顯降低(分別為0.77±0.13、0.65±0.18、0.69±0.18、0.73±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為5.45、6.30、5.08、11.64，P<0.001)。

表2 兩組受孕小鼠胚胎數(shù)、胚胎及胎盤重量比較 (x±s)Tab.2 Comparison of litter size, fetal and placental weight between the mice in two groups SOP group and NSP group (x±s)

圖2 兩組受孕小鼠孕18.5 d的胎盤迷路層(L)及連接層(J) (HE染色，×40)Fig.2 Placental labyrinth layer (L) and junction layer (J) at E18.5 d in the mice of two groups (HE staining, ×40)

2.5 兩組胎盤MVM中SNAT2蛋白含量比較 Western blotting檢測結(jié)果顯示，超促排受體組MVM中的SNAT2蛋白含量(0.32±0.01)明顯低于自然交配受體組(0.65±0.15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.29，P<0.001，圖4)。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，與自然交配受體組比較，超促排受體組孕18.5 d的胚胎及胎盤重量明顯減輕，胎盤組織結(jié)構(gòu)未見明顯病理學(xué)改變，但胎盤組織中GSH含量明顯減少，MDA含量明顯增多，說明超促排受體組胎盤處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，人為增加狒狒孕早期雌激素水平，可致滋養(yǎng)層入侵蛻膜、子宮動脈重構(gòu)受損，胎盤血供不足，胎盤組織處于缺氧狀態(tài)[7-8]，而胎盤組織缺血缺氧易導(dǎo)致線粒體功能障礙，產(chǎn)生大量自由基，胎盤氧化-抗氧化平衡狀態(tài)失調(diào)，從而使胎盤處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖3 兩組孕18.5 d胎盤迷路層及連接層的細(xì)胞凋亡情況 (TUNEL, ×400)Fig.3 Apoptosis of placental labyrinth layer and junction layer at E18.5 d (TUNEL, ×400)

表3 兩組受孕小鼠胎盤迷路層、連接層面積及細(xì)胞凋亡率比較 (x±s, n=6)Tab.3 Comparison of the areas and apoptosis rates of placental labyrinth layer and junction layer between the mice in two groups (x±s, n=6)

表4 兩組受孕小鼠胎盤組織中GSH、MDA含量比較 (x±s, n=6)Tab.4 Contents of GSH and MDA in placental homogenates of mice in SOP group and NSP group (x±s, n=6)

圖4 兩組受孕小鼠胎盤組織中SNAT2蛋白的表達(dá)水平(Western blotting)Fig.4 Expression levels of Snat2 and β-actin protein in placental MVM of mice in SOP group and NSP group (Western blotting)

研究顯示，氧化應(yīng)激可引發(fā)胎盤組織細(xì)胞凋亡，并影響胎盤營養(yǎng)物質(zhì)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[9-11]。本研究采用TUNEL技術(shù)檢測了胎盤組織細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)超促排受體組胎盤組織細(xì)胞凋亡率明顯高于自然交配受體組。胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體分為三大類：A型Na+依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，介導(dǎo)非必需中性氨基酸的攝取，如丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸；L型Na+非依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，介導(dǎo)必需中性氨基酸的攝取，如亮氨酸；β型Na+依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，介導(dǎo)?；撬岬臄z取。A型Na+依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體主要包括Snat1(SLC38A1)、Snat2(SLC38A2)及Snat4(SLC38A4)。L型Na+非依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體由輕鏈及重鏈構(gòu)成，輕鏈為Lat1(SLC7A5)、Lat2(SLC7A8)，重鏈為4F2hc/Cd98(SLC3A2)。β型Na+依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體為?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體(taurine transporter，Taut)[12]。本研究采用熒光實(shí)時定量PCR檢測了胎盤組織氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體Snat1、Snat2、Snat4、Lat1、Lat2、Cd98、Taut mRNA水平，發(fā)現(xiàn)超促排受體組的Snat1、Snat2、Lat2、Taut mRNA表達(dá)明顯降低，其中Snat2 mRNA下降最明顯。

氨基酸自母體轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒，需跨越靠近母體血液循環(huán)的MVM、靠近胚胎毛細(xì)血管的基底膜(BM)及胚胎毛細(xì)血管內(nèi)皮。氨基酸跨越胎盤MVM、BM由膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)，跨越胚胎毛細(xì)血管內(nèi)皮較容易，只需通過毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的縫隙。因此，胎盤MVM是氨基酸自母血轉(zhuǎn)運(yùn)至胚胎的首過限速屏障，其關(guān)鍵取決于MVM氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。研究顯示，妊娠合并宮內(nèi)發(fā)育遲緩時，胎盤MVM氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)下調(diào)，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體活性明顯降低[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，超促排受體組的胎盤MVM氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體Snat2蛋白表達(dá)較自然交配受體組明顯降低。筆者推測其可能的機(jī)制為：COH引發(fā)小鼠胎盤氧化應(yīng)激，胎盤組織凋亡細(xì)胞異常增加，胎盤MVM氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)下調(diào)，胚胎攝取氨基酸受限，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎生長發(fā)育遲緩。但COH引發(fā)的胎盤氧化應(yīng)激具體通過何種信號通路導(dǎo)致胎盤組織細(xì)胞凋亡及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)下調(diào)，尚有待于進(jìn)一步研究。