程 亮

(青海省農林科學院植物保護研究所 青海省農業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016)

【研究意義】馬鈴薯 Y 病毒(Potato virus Y，PVY)是茄科植物最常見、危害最嚴重的病害之一，廣泛分布于馬鈴薯產區(qū)，可單獨或與其它病毒混合侵染，導致馬鈴薯出現(xiàn)種薯質量退化和產量下降，嚴重時減產80 %以上[1-2]。馬鈴薯Y病毒存在株系嚴重分化現(xiàn)象，在全球的不同馬鈴薯種植區(qū)都可以檢測出不同的株系，不同的株系侵染的癥狀不同，造成的產量損失也不盡相同，在我國的主要馬鈴薯種植區(qū)，PVY的檢出率高達94 %，在馬鈴薯病毒中占主要地位[3]。青海省是我國西北馬鈴薯主產區(qū)之一，常年播種面積約4000 hm2，年產鮮薯26.62×104t[4]，雖然近年來在種薯和微型薯生產中對PVY進行了嚴格的監(jiān)控，但由于PVY的發(fā)生流行是靠帶毒蚜蟲和病汁液傳播來實現(xiàn)的[5]，從而導致PVY在田間發(fā)病依然很重；同時隨著種薯調運和種質資源交流的頻繁，促進了PVY不同株系在不同地區(qū)之間的傳播，加速了新的重組株系的產生，提升了人們監(jiān)測防控該病毒的難度[6]。因此，明確PVY在青海地區(qū)馬鈴薯上的株系類別和分布，對于早期檢測和開展有效防控具有十分重要的意義。【前人研究進展】PVY是正義單鏈RNA病毒，其基因組長約9.7 kb，包含一個開放閱讀框，基因表達時翻譯成10個成熟的功能蛋白[7]。目前，PVY 分離物主要劃分為PVYO、PVYN、 PVYC、PVYZ和PVYE5個株系。但PVY 在進化過程中存在基因重組頻繁發(fā)生，株系分化嚴重，重組株系不斷出現(xiàn)[6]。最近在歐洲、美洲等地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了PVYNTN[8-9]、PVYNW[10]、PVYN:O[11-12]、PVYNA -NTN[13]、PVY(Z)-NTN[14]等新株系。關于對PVY新分離物株系檢測，目前研究人員一般通過單個基因[15]或全基因組序列[16]的同源性比對，或通過血清型[17]、基因組重組與否[18]、PTNRD效應[19]、過敏反應互作基因[20]等這些標準來劃分其株系類別。鑒于PVY株系群體的復雜性和易變性，而上述 PVY 株系劃分標準都無法完全區(qū)分所有PVY株系類別，都存在一定程度的缺陷[21]。近年來，隨著測序技術的日漸成熟，通過PVY基因組差異區(qū)段的短序列測序來劃分 PVY株系是目前最準確劃分株系類別的方法，其中一個差異區(qū)段位于P1蛋白產物中，該蛋白是PVY 10個重要的結構蛋白之一[22]，是基因組中重組發(fā)生的熱點區(qū)域，研究表明，P1蛋白干擾寄主防御反應、病毒復制以及PVY相關癥狀的形成等[23]。目前，許多研究者利用P1基因序列對PVY分離物進行同源性分析和系統(tǒng)進化分析，以確定株系類別。陳士華[24]等通過分析黑龍江、貴州、山西馬鈴薯主產區(qū)PVY分離物P1基因的分子特征，發(fā)現(xiàn)侵染馬鈴薯的PVY優(yōu)勢株系為NTN和N:O株系；史鳳陽[25]等結果表明，福建馬鈴薯主產區(qū)PVY分離物中產生了新的重組株系，為N株系重組而來的N-Wi類型，也有部分O株系；沈林林[26]等利用病毒P1、VPg和CP多個基因分析了福建省PVY馬鈴薯分離物，明確了侵染馬鈴薯的優(yōu)勢種群為N株系中的NW-NTN型。韓樹鑫[27]等對黑龍江15個馬鈴薯Y病毒樣品的P1基因進行克隆測序和進化樹分析，經比對分析發(fā)現(xiàn)，其中的10個樣品的P1基因與PVYNTN-NW株系親緣關系最近，是黑龍江地區(qū)的優(yōu)勢株群，該結果說明黑龍江地區(qū)的PVY來源也以重組株系為主。因此，P1基因序列分析在很大程度上對PVY株系的劃分具有重要的參考價值。【本研究切入點】目前，對于PVY株系在青海馬鈴薯上的發(fā)生情況、分布類型和分子特征等方面尚未有系統(tǒng)的報道，影響了對PVY有效地開展早期監(jiān)控措施。因此，研究明確青海馬鈴薯產區(qū)PVY的株系種類有助于了解該病毒的變異類型和流行區(qū)域的形成?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過對馬鈴薯Y病毒的P1基因進行研究，通過對PVY的P1基因區(qū)域序列進行擴增，進一步了解青海省馬鈴薯PVY株系的類型和分布，為制定PVY的綜合防控策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣采集 2016年5-8月，在馬鈴薯生長期對青海省的馬鈴薯主產區(qū)進行田間調查，調查方法為隨機取樣，采集帶有皺縮、重度花葉、黃化等明顯癥狀的馬鈴薯葉片，新鮮樣本置于密封袋中，保存于-80 ℃超低溫冰箱。調查縣區(qū)包括樂都、民和、互助、湟中、湟源、平安、大通和西寧(表1)。

1.1.2 主要試劑及引物 Trizol、DEPC、TransScript First-Strand cDNA購于Sigma公司；DNA Marker、Gel Purification Kit購于天根生化科技(北京)有限公司；EcoR I限制性內切酶購于Promega公司； RNase 抑制劑、T4DNA連接酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pGM-T easy PCR 產物克隆試劑盒、質粒小提試劑盒購于北京天為時代科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其它化學試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 依據(jù) PVYP1基因上、下游核苷酸序列有一定變化，引用了國際上擴增P1段的通用引物[28]。其中 PVYP1基因上游引物M40-5序列為5'- GGATCCAATTAAAACAACTCAATA-3'，下游引物 NTN-R序列為5'-CATTTGTGCCCAATTGCC-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 馬鈴薯總RNA提取 按照Trizol試劑盒提取樣品總RNA。提取試驗的所有離心操作均在 4 ℃下完成，用分光光度法測定RNA濃度及純度，用電泳法檢測RNA完整性，然后-80 ℃超低溫冰箱保存。

表1 樣品來源

1.2.3 RT-PCR擴增PVYP1基因 ①cDNA第一鏈的合成。以感染PVY的馬鈴薯葉片總RNA為模板，逆轉錄反應體系為10 μl，取總RNA提取液1 μl，72 ℃變性后立即置于冰上，加入下述反應混合液：M-MLV RT-Buffer 2 μl，10 mmol/L dNTPs 2 μl，40 U/μl RNasin 0.5 μl，10 pmol/μl PVY下游引物1 μl，200 U/μl M-MLV 反轉錄酶0.5 μl，DEPC處理水3 μl，混合后42 ℃保存1 h，95 ℃處理5 min。② RNA質量和馬鈴薯PVY病毒的RT-PCR檢測。PCR反應擴增總體系為50 μl，采用Touch down PCR方法，反應體系：10×PCR Buffer 5.0 μl，MgCl2(2.5 mol/L) 4.0 μl，dNTPs (2.5 mmol/L) 5.0 μl，M40-5 (10 μmol/L) 2.0 μl，NTN-R (10 μmol/L) 2.0 μl，Taq(5 U/μl) 0.5 μl，ddH2O 27.5 μl，cDNA 4 μl。 PCR反應條件為：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變形 30 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，5個循環(huán)；94 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸90 s，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，10個循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸90 s，共10個循環(huán)；最后一輪循環(huán)后72 ℃延伸10 min。4 ℃存放。PCR產物用 1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR 產物純化后克隆至pGM-T載體上，并轉化至DH 5α感受態(tài)細胞之中。經菌落 PCR 鑒定獲得陽性重組質粒，隨機選擇陽性克隆子委托上海生工生物工程有限公司測序，并通過測序峰圖及序列比對分析排除由 PCR 擴增引起的突變。

1.2.4 序列分析及同源性比對 測序獲得的序列分別采用 DNAMAN 8.0軟件進行生物信息學分析。為了進一步了解 PVY不同分離物的系統(tǒng)發(fā)育關系，從GenBank中選取已知株系的PVYP1基因序列作為參考，并使用MEGA 6.0軟件，通過最大相似法(Maximum Likelihood)，在1000個重復下(Bootstrap trials)進行系統(tǒng)進化分析。

2 結果與分析

2.1 P1基因的擴增與克隆

本實驗引用的是國際上通用擴增P1的1對引物(M40-5/NTN-R)，使用Touch down PCR方法對樣品中PVYP1部分基因序列進行擴增，1 %的瓊脂糖電泳，結果顯示擴增后的PCR產物大小約為1100 bp (圖1)，3個分離物均擴增到目的片段，陰性空白對照(健康馬鈴薯葉片)未擴增到相應的片段。 RT-PCR 擴增到的目的片段克隆、測序后利用DNAMAN8.0進行建樹序列多重比對，經比對后序列長度為825 bp。

2.2 馬鈴薯PVY P1基因序列比對和序列分析

PVY病毒P1基因的PCR擴增產物經測序后，使用DANMAN8.0軟件將獲得的18個PVY的P1基因序列進行同源性分析，檢測樣品的PVYP1基因的核苷酸序列比對結果可以看出，PVY 的P1序列全長共825個堿基，編碼275個氨基酸，樣品序列比對中同源性為90.3 %～100 %，說明此次進行序列擴增PVY樣品間有一定的序列差異，可能發(fā)生的一定的多堿基重組及突變現(xiàn)象(圖2)。樣品的基因序列可被分為2組，其中一組為Y-39、Y-47、和 Y-51 3個樣品，約占試驗所用樣品數(shù)量的17 %，這幾個樣品的P1基因除了和別的檢測樣品發(fā)生堿基突變外，Y-39、Y-47、Y-51的P1基因還主要集中在321～561 bp段分別發(fā)生55、58、61處的堿基置換。這3個樣品基因的同源性為是97.7 %，而這3個樣品和剩余的檢測樣品的堿基序列比對差異較大。剩余的檢測樣品共15個，15個檢測樣品中P1基因僅有部分單個堿基發(fā)生突變或置換，發(fā)生堿基突變或置換的共有21處。這21處的堿基有17處的堿基只有1個檢測樣品在此處發(fā)生了堿基置換，剩下的4處也發(fā)生規(guī)律性改變，如P1基因序列中的第110處，C變成了T、247處，G變成了A、423處，C變成了T、656處T變成了C。它們的P1基因同源性為在99.6 %。兩組組間基因一致率僅為91 %。

M: DNA分子質量標準；1：陰性對照；2～4：馬鈴薯分離物M: 2000 bp DNA Marker；1： Negative control；2-4： Samples from potato圖1 PVY馬鈴薯分離物P1基因RT-PCR檢測結果Fig.1 RT-PCR products of PVY P1 gene amplified from potato leaf total RNA

圖2 檢測樣品的PVY P1基因的核苷酸序列比對結果Fig.2 The contrast of PVY P1 gene alignment sequences of samples

圖2 檢測樣品的PVY P1基因的核苷酸序列比對結果(續(xù))Fig.2 The contrast of PVY P1 gene alignment sequences of samples(Continued)

圖2 檢測樣品的PVY P1基因的核苷酸序列比對結果(續(xù))Fig.2 The contrast of PVY P1 gene alignment sequences of samples(Continued)

2.3 與已報道馬鈴薯PVY P1基因序列的進化分析

利用ClustalW進行建樹序列多重比對，經比對后序列長度為825 bp。將比對后的序列，使用ML法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖3)所示，GenBank中已發(fā)表的國家和地區(qū)的PVY分離物P1基因序列24個(表2)，將 GenBank中已知分離物P1序列，與本次實驗中測定的分離物P1序列進行進化樹分析，由進化樹可以發(fā)現(xiàn)，所有的分離物序列被分為3個大組，將它們稱為A、B和C組，A組中分離物P1基因序列數(shù)量大于B和A組，而本次試驗所選取的青海省各地區(qū)的樣品只在A和B組，其中主要高度集中在A組，B組只有4個檢測樣品。另外，根據(jù)GenBank中已經上傳的序列提供的PVY株系信息，來自巴西JQ924286、來自德國的AJ890350、來自波蘭的KX356070、來自南非的JN936419和JN936437這5個序列的P1基因都屬于PVYN-Wi株系，而本次試驗選用14個 PVYP1基因檢測樣品的株系都接近這5個序列，包括來自樂都的Y-5、Y-43，來自平安的Y-8和Y-50，來自互助的Y-9和Y-44，來自大通的Y-14和Y-52，來自湟中的Y-19和來自湟源的Y-26、Y-31，來自民和的Y-40以及來自西寧的Y-45、Y-54都與PVYN-Wi株系遺傳距離較近。它們都屬于A組。屬于B組PVYNTN株系是來自民和的Y-39，來自西寧的Y-46、Y-47和來自湟中的Y-51。C組成員包括PVYO株系、PVYC株系、PVYN:O株系等4個株系，但是本次試驗所選取的青海省各地區(qū)的樣品沒有到屬于C組的?？赡芮嗪Ｊ●R鈴薯跨省資源交流和種薯調運自由度高，以及PVY本身易變異的特性，所以會有Y-39、Y-46、Y-47和Y-51等少量樣品P1基因比本試驗大部分樣品具有更復雜的變化的情況存在。

3 討 論

馬鈴薯 Y 病毒(Potato virus Y， PVY)是馬鈴薯 Y 病毒屬(Potyvirus)的代表種，是危害馬鈴薯等茄科作物最重要病毒之一。PVY通過不斷積累的堿基位點突變和基因重組來實現(xiàn)自身的進化，不斷形成 PVY新株系。在PVY基因組中，P1、NIb、HC-Pro和CP等區(qū)域常發(fā)生基因重組、移位或突變，但P1基因區(qū)段的變異和基因重組發(fā)生頻率要高于外殼蛋白和其它結構區(qū)域基因。P1基因區(qū)的重組發(fā)生的類型有2個，一是PVYN和PVYO株系初始基因組在不同區(qū)段的重組，二是P1基因區(qū)內堿基位點的移位或突變。因此，對P1基因的分子變異和聚類分析將對PVY株系的劃分起到參考價值。

表2 各地的不同來源PVY P1基因序列

本試驗對青海馬鈴薯18個分離物P1基因區(qū)域進行分析，結果表明不同分離物間P1核苷酸序列存在著差異，同源性在90.3 %～100 %。史鳳陽[25]等研究發(fā)現(xiàn)12個福建分離物P1基因之間核苷酸序列一致性為 73 %～99 %，高度變異的P1蛋白中有85個變異的氨基酸位點，不同株系型的系統(tǒng)發(fā)育關系分化較大，最終證實了P1基因的變異主要來自堿基突變和基因重組。本試驗對PVY青海馬鈴薯分離物P1基因區(qū)域與GenBank中24個已發(fā)表的PVYP1基因進行進化樹分析，發(fā)現(xiàn)所有P1可分為A、B、C 3組，14個青海分離物均聚集在了A組，與PVYN-Wi株系聚為一簇；其余4個青海分離物聚集在了B組，與PVYNTN株系聚為一簇。而PVYN-Wi和PVYNTN是PVYO和PVYN在不同基因區(qū)段發(fā)生重組的株系，即 N×O 重組株系，表明青海地區(qū)的PVY來源也以重組株系為主，而不是以過去常見的PVYN和PVYO等未經重組的純株系，這與大多數(shù)研究的結果相同[25,27,29-30]，重組株系的產生是源于基因重組還是堿基位點突變，有待于進一步研究。

此外，本試驗對P1基因的進化樹分析發(fā)現(xiàn)，Y-39、Y-46、Y-47和Y-51分離物與PVYNTN不能形成緊密的枝簇，與PVYNTN的親緣關系有一定的距離，且這4個分離物間也有一定的差異。吳興泉[31]等通過對已發(fā)表的33個分離物的 PVY P1蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)， PVY不同分離物間P1蛋白氨基酸序列存在明顯差異，同源性在 64 %～94 %；通過系統(tǒng)關系樹分析表明，福建的1個分離物與已發(fā)表的17個分離物的氨基酸序列同源性均在92 %以上，與16個已發(fā)表的分離物的氨基酸序列同源性均小于90 %。Nie[18]等利用多對引物擴增 PVY 的P1基因區(qū)域以確定病毒株系，但部分引物只能適合在特定的PVY分離物中使用，原因是P1基因區(qū)域保守性較低，基因突變/重組頻率相對較高，無法確定特定的引物能否適用于其他的PVY分離物。所以，利用單一P1基因序列作為分子標簽進行系統(tǒng)發(fā)育分析，無法對PVY重組株系進行準確鑒定?；蛟S采用聯(lián)合基因分析(例如和CP基因)，能夠更準確地對PVY重組株系進行劃分。

圖3試驗樣品與各地樣品的P1序列構建進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of P1 sequences from the test samples and others

遺傳變異是RNA病毒的特征之一，也是病毒進化的策略之一，P1蛋白以及編碼相應蛋白的P1基因不論在數(shù)量和氨基酸/核苷酸序列上是PVY中分化最顯著的一個蛋白/基因。由于PVYP1基因區(qū)域內存在多種變異類型，基因重組或突變易發(fā)生，絕大部分PVY株系的重組和突變都發(fā)生在該區(qū)域，因此，進行P1基因的分子變異分析對PVY分離物的株系劃分仍具有重要的意義，且該基因區(qū)域已被大多數(shù)學者研究利用。與PVY非重組株系相比， PVY重組株系具有相對強的生存和進化優(yōu)勢，可以快速適應新的寄主和環(huán)境，具有更強的致病力。對于青海省PVY重組株系的發(fā)現(xiàn)，有助于了解青海省PVY株系的變異規(guī)律、發(fā)展趨勢和分布特點。但由于可供分析的分離物樣品數(shù)量有限，不排除有PVY的其他株系的存在?；蛘咄ㄟ^種薯的區(qū)域間的相互調運，不排除未來其他重組株系的發(fā)生。因此，青海馬鈴薯PVY重組株系的發(fā)展趨勢值得關注。

4 結 論

青海省馬鈴薯Y病毒P1目的基因共825個堿基，編碼275個氨基酸；經比對樣品的P1基因序列，核酸一致率達90.3 %～100 %，其中Y-39、Y-47和Y-51 3個樣品與其它樣品有55～61個堿基的差異；試驗樣品與國內外已報道的PVYP1基因相比較，經進化樹分組后，主要分為A、B、C 3組，其中A組中，包含了大部分來自青海的樣品，是本地區(qū)的優(yōu)勢組群；而另一組的4個樣品的P1基因與本地優(yōu)勢組群有較大差異，且4個樣品間也有一定的差異。通過與GeneBank中已上傳的序列提供的信息相比對，發(fā)現(xiàn)14個樣品的P1基因與PVYN-Wi株系較近；其余4個樣品與PVPNTN株系較近。