于淼，陳冰嬬，石貴山，李海清，葛占宇，楊永志，徐寧，檀輝，李翠麗，王鼐

（1.吉林省農業(yè)科學院作物資源研究所，吉林公主嶺136100；2.赤峰市農牧科學研究院，內蒙古赤峰024031）

土壤鹽堿化是影響植物生長并限制作物產量的嚴重農業(yè)問題之一［1，2］。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球鹽堿土面積大約有9.8×108hm2，約占全球土地面積的10%，中國鹽堿土總面積大約有1.0×108hm2，占耕地總面積的 4.9%，且有逐年增加的趨勢［3，4］。其中東北地區(qū)是土壤鹽堿化最嚴重的地區(qū)之一，主要成分是以Na2CO3和NaHCO3為主的蘇打鹽堿土［5］。其具有與中性鹽脅迫相同的Na+離子毒害作用，大量的CO32+、HCO3

-使土壤 pH 升高，嚴重影響了作物體內核酸復制、蛋白質合成等代謝過程，抑制種子萌發(fā)進程［6］，堿脅迫對作物的危害高于鹽脅迫［7］。培育和推廣耐鹽堿作物是提高鹽堿地宜耕土地面積最為經濟有效的措施。

高粱（Sorghnm bicolor（L.）Moench）具有耐旱、耐鹽堿等多重抗逆性，且光合效率高，廣泛種植在我國的旱地、洼地、鹽堿地等邊際性土地上［8，9］。目前種植的高粱品種以釀酒專用型的粒用雜交種為主［10］。因此，建立不同粒用高粱親本系耐堿鑒定方法和評價體系對高粱耐堿種質創(chuàng)新和雜交種選育以及堿土有效利用具有重要意義。然而對于混合堿脅迫研究，多集中在甜高粱［11］和雜交種［12］的鑒定篩選，可用的耐堿種質資源和基因未見報道，制約著高粱耐堿育種的發(fā)展。李豐先等［12］以 25 mmol·L-1混 合 堿（NaHCO3∶Na2CO3的摩爾比為9∶1）溶液為脅迫液，綜合評定了35 個高粱雜交種的耐堿性。尚培培等［13］以耐堿性差異較大的2 個雜交種為材料，研究了混合堿脅迫對高粱幼苗生理生化的影響。任增根等［14］用混合堿（NaHCO3∶Na2CO3摩爾比 1∶1）篩選鑒定了 8 個高粱品種的耐堿性。

本研究分析146 份粒用高粱親本系堿脅迫下萌發(fā)期的各個性狀，采用隸屬函數(shù)值法轉換的S 值對耐堿性進行分級，建立了一種準確高效的粒用高粱耐堿鑒定評價方法，為粒用高粱親本系萌發(fā)期耐堿性鑒定提供理論依據(jù)以及高粱耐堿種質創(chuàng)制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為146 份粒用高粱親本系，包括53份保持系（B-line）、93 份恢復系（R-line），分別來自吉林省農業(yè)科學院、吉林農業(yè)大學、白城市農業(yè)科學院、錦州市農業(yè)科學院，遼寧省農業(yè)科學院、赤峰市農牧科學院、黑龍江省農業(yè)科學院、山西省農業(yè)科學院、中國農業(yè)科學院、美國得克薩斯農業(yè)與機械大學、澳大利亞昆士蘭大學。由吉林省農業(yè)科學院作物資源所保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 堿脅迫適宜濃度的確定

挑 選 吉 2055B、 314B、 SX44B、 522B、TAM428B、15H379、GLS、G002、LT、2115 共 10份材料，設置 NaHCO3∶Na2CO3=9∶1 摩爾質量濃度分別為 0（CK）、25、50、75、100、150 和 200 mmol·L-1（實際測得的pH 和電導率見表1）溶液進行脅迫，共6 個處理，每個處理3 次重復，每次重復 25粒種子。將種子用自來水清洗2 次，75%的酒精消毒1 min，經0.1%的氯化汞溶液消毒10 min，自來水沖洗3 次，去離子水沖洗3 次，吸干種子表面水分，放入鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中。加入堿脅迫液8 mL，溫度25℃，濕度60%的培養(yǎng)箱內黑暗培養(yǎng)10 d。每2 d 補充適量蒸餾水，以保持脅迫液的濃度不變。第4 天調查每個培養(yǎng)皿的種子發(fā)芽數(shù)（發(fā)芽的標準為胚根長度≥1/2 種子長度），計算種子的發(fā)芽勢。第10 天調查每個培養(yǎng)皿的種子發(fā)芽數(shù)，計算種子發(fā)芽率，每個培養(yǎng)皿挑選生長時期基本一致的10 株幼苗，測量芽長、根長。

1.2.2 146 份粒用高粱親本系對堿脅迫的響應

選取 50 mmol·L-1濃度的堿脅迫液處理 146 份粒用高粱親本系，種子處理與培養(yǎng)方法與堿脅迫適宜濃度的確定一致。分別于第 2、4、6、8、10 天調查每個培養(yǎng)皿的種子發(fā)芽數(shù)。在第10 天，將放在培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)皿取出，每個培養(yǎng)皿挑選基本一致的10 個幼苗，測定芽長、根長、中胚軸長、芽鮮重、根鮮重，于85 ℃烘干后稱量芽干重、根干重。

發(fā)芽勢=第4 天發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100%；

發(fā)芽率=第10 天發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑(Gt/Dt)（其中，Gt 為第 t日的發(fā)芽種子個數(shù)，Dt 為相應的發(fā)芽日數(shù)）；

活力指數(shù)（VI）=胚根鮮重×發(fā)芽指數(shù)；

相對值=脅迫值/對照值×100%。

表1 不同堿脅迫溶液的pH 和電導率Table 1 Conductivity and pH of different saline-alkali stress solutions

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS19.0 軟件對測定指標數(shù)據(jù)進行方差分析、主成分分析和相關性分析。在EXCEL 2010 中采用公式（1）計算隸屬函數(shù)值，采用公式（2）計算耐堿評價S 值。

公式（1）中計算各性狀的隸屬函數(shù)值，Xj表示第j 個性狀的相對值；Xmin、Xmax分別表示第 j 個性狀相對值的最小值和最大值。公式（2）計算各性狀的平均隸屬函數(shù)值。

2 結果與分析

2.1 粒用高粱萌發(fā)期耐堿鑒定適宜濃度的確定

不同濃度蘇打堿脅迫下，10 份高粱種質的發(fā)芽勢等5 個萌發(fā)性狀的統(tǒng)計分析表明（表2），在濃度為25 mmol·L-1脅迫處理下，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、芽長、根長與對照相比差異不顯著，但是2055B、15H379、2115 的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長和根長均高于對照。在50 mmol·L-1脅迫處理下，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、芽長、根長與對照相比在0.01 水平下極顯著降低，尤其根長與對照相比明顯下降，下降了65.75 %，然而522B、SX44B 與對照相比，發(fā)芽勢和發(fā)芽率變化不明顯。在75 mmol·L-1脅迫處理下，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽勢的均值降為對照的一半，高粱的根長表現(xiàn)無或極短。脅迫濃度升高到150 mmol·L-1，所有材料的萌發(fā)均受到明顯抑制，各萌發(fā)指標值均顯著下降。200 mmol·L-1脅迫下，少數(shù)材料能夠萌發(fā)，但萌發(fā)后期多為畸形、壞死、不能正常生長。因此，本試驗選用50 mmol·L-1（NaHCO3∶Na2CO3=9∶1）為粒用高粱萌發(fā)期耐堿鑒定的適宜濃度。

表2 不同濃度堿脅迫下10 份高粱種質性狀的統(tǒng)計分析Table 2 Statistic analysis of 10 sorghum germplasm traits at different alkali concentrations

2.2 堿脅迫對萌發(fā)期粒用高粱親本系的影響

對146 份粒用高粱親本系萌發(fā)期性狀相對值的描述統(tǒng)計表明，在 50 mmol·L-1的堿脅迫下，除部分親本系的發(fā)芽勢和發(fā)芽率外，萌發(fā)期各性狀相對值均小于100%，表明各性狀均受到不同程度地抑制，不同性狀相對值的均值和變異系數(shù)也不相同（表 3）。 其中，相對根長均值最低，為12.36%；相對中胚軸長度次之，為15.51%，相對發(fā)芽勢均值最大，為68.25%；說明在堿脅迫下高粱的根長和中胚軸的長度抑制程度較大，發(fā)芽勢的抑制程度較小。各性狀相對值變異系數(shù)最大的是根長，為82.18%，說明堿脅迫下粒用高粱親本系的根長差異最明顯，變異系數(shù)最小的是發(fā)芽勢，為29.72%。

2.3 粒用高粱親本系萌發(fā)期耐堿分級評價方法

通過計算11 個相對性狀的平均隸屬函數(shù)值，獲得耐堿評價S 值。根據(jù)S 值對146 份參試材料劃分耐堿分級評價標準。S 值在0.80～1.00 為1級強耐堿（HT），0.60～0.80 為 2 級耐堿（T），0.40～0.60 為 3 級中等耐堿（MT），0.20～0.40 為4 級 堿 敏 感（S），0.00～0.20 為 5 級 堿 極 敏 感（HS）。

表3 堿脅迫下粒用高粱親本系萌發(fā)期性狀相對值的描述統(tǒng)計Table 3 Descriptive statistics on relative traits of sorghum parental lines at germination stage under alkali stress 單位：%

2.4 146 份粒用高粱親本系萌發(fā)期耐堿性評價

根據(jù)分級標準對146 份粒用高粱親本系的S值進行耐堿級別的劃分（表4）。耐堿1 級的包括吉4327R 1 份材料，屬于恢復系，占參試材料的0.68%，耐堿評價為HT。耐堿2 級的包括MH、G17-123B、5222B、SX44B、TAM428B、06H419、吉R117、15H369，共8 份材料，其中保持系材料4份，恢復系材料4 份，占參試材料的5.47%，耐堿評價 為 T。 耐 堿 3 級 的 包 括 LT、7788、10125R、QL34B、吉 R107 等，共 62 份材料，其中保持系材料29 份，恢復系材料33 份，占參試材料的42.46%，耐堿評價為MT。耐堿4 級的包括2483、哲3B、2013B1、y288-2、115B 等，共 56 份材料，其中保持系材料14 份，恢復系材料42 份，占參試材料的38.35%，耐堿評價為S。耐堿5 級的包括龍188B、2124、外 4、哲 23B、5933、QL33B，共 19 份材料，其中保持系材料6 份，恢復系材料13 份，占參試材料的13.01%，耐堿評價為HS。

表4 146 份粒用高粱親本系耐堿性評價Table 4 Evaluation of alkali tolerance of 146 sorghum parental lines

2.5 堿脅迫下粒用高粱萌發(fā)期各性狀的相關性分析

對堿脅迫下粒用高粱親本系萌發(fā)期11 個性狀的相對值進行相關性分析（表5），相對根長、相對根鮮重和相對根干重與相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對中胚軸長度之間相關不顯著，與其余7 個指標之間呈顯著或極顯著正相關。其中，相對發(fā)芽指數(shù)與相對發(fā)芽勢呈極顯著正相關，相關系數(shù)最高，達到了0.942，相對活力指數(shù)與相對根鮮重呈極顯著正相關，相關系數(shù)為0.872。相對中胚軸長與相對芽長呈極顯著正相關，相關系數(shù)為0.774。S 值與萌發(fā)期各性狀相對值之間均呈顯著正相關，與相對芽鮮重相關系數(shù)最高，為0.891，與相對根干重相關系數(shù)最低，為0.326。

表5 堿脅迫下粒用高粱萌發(fā)期各性狀的相關性分析Table 5 Correlation analysis of different traits of sorghum germination under alkali stress

2.6 粒用高粱萌發(fā)期耐堿性狀的主成分分析

對堿脅迫下粒用高粱親本系萌發(fā)期11 個性狀的相對值進行主成分分析（表6）。第Ⅰ主成分貢獻率為50.49%，第Ⅱ主成分貢獻率為20.80%，第Ⅲ主成分的貢獻率為10.57%，前3 個主成分累計貢獻率達81.877%，考慮累計貢獻率大于80%和特征值大于1 的原則，說明前3 個主成分能夠代表11 個性狀的基本信息，符合主成分分析的要求。

從各個指標的載荷矩陣分析（表7），相對芽長、相對芽鮮重和相對芽干重，相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽指數(shù)在第I 主成分中的載荷比較大，說明第Ⅰ主成分主要反映的是胚芽萌發(fā)生長的重要指標，其中相對芽鮮重的載荷量最大，為0.90。在第II 主成分中相對活力指數(shù)，相對根長與相對根鮮重、相對根干重的載荷較大，反映的是根部性狀的重要指標，其中相對根鮮重載荷量最大為0.8。第III 主成分中相對中胚軸長、相對芽長、相對根長的載荷量較大，反映的是種子伸長的狀況，其中相對中胚軸長載荷量最大為0.54。

表6 3 個主成分的特征值及貢獻率Table 6 Eigenvalue and contribution rates of three principal components

2.7 粒用高粱萌發(fā)期耐堿性鑒定指標的篩選

計算相對根鮮重、相對發(fā)芽率和相對中胚軸長性狀的平均隸屬函數(shù)值S1，以S1值為橫軸，S 值為縱軸，繪制兩者間的線性關系圖（圖1），兩者也呈極顯著相關（P＜0.01），相關系數(shù)為0.9421。根據(jù)分級標準對146 份粒用高粱親本系的S1值進行耐堿評價，編號98 的吉4327R 的平均隸屬函數(shù)值最高，為 0.8408，編號 124 最低，為 0.013，與 11 個指標的平均隸屬函數(shù)值排序一致。只有21 份種質在耐堿分級稍有不同，其余125 份材料耐堿分級一致。由此可知，利用相對中胚軸長、相對芽鮮重、相對根鮮重這3 個性狀對146 份粒用高粱親本系的評價結果與11 個性狀的評價結果基本一致，可以作為粒用高粱萌發(fā)期耐堿性篩選的鑒定指標。

表7 各因子載荷矩陣Table 7 Factor loading matrix of each component

圖1 S1值與S 值評價高粱耐堿性的關系Fig.1 Evaluation of sorghum alkali tolerance based on S1 value and S value

3 討論與結論

我國現(xiàn)有鹽堿地類型復雜，土壤中鹽分組成多樣［15］。吉林省中西部鹽堿化地區(qū)的土壤主要含有 Na+、CO32-、HCO3-，pH 在 9.0 以上［16］。而且，以Na2CO3和NaHCO3為主要成分的堿脅迫對植物生長發(fā)育的危害遠大于NaCl 與Na2SO4為主的鹽脅迫［17，18］，本試驗將 2 種堿性鹽 NaHCO3和 Na2CO3按摩爾比 9∶1 配置，混合液的 pH 在 9.25 左右，以此模擬吉林省中西部土壤環(huán)境更加具實踐意義。

作物萌發(fā)期耐鹽性研究發(fā)現(xiàn)，不同作物對鹽脅迫的響應不同，耐鹽鑒定的適宜濃度也不相同［19～21］。相同作物不同基因型種質對鹽響應的濃度也不相同［22，23］。本研究測量了 10 份材料在不同堿脅迫濃度下的5 個萌發(fā)性狀，發(fā)現(xiàn)隨著堿濃度的增加高粱的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、芽長、根長均呈下降趨勢。在25 mmol·L-1脅迫下，個別材料的萌發(fā)能力強于對照，說明該濃度對高粱親本系的萌發(fā)有促進作用，但是當濃度增加到50 mmol·L-1時，各性狀較對照均顯著降低。這說明高粱在適宜堿脅迫濃度下萌發(fā)能力會增強，超過一定濃度后才會產生抑制作用，這與小麥［24］、芝麻［25］、棉花［26］等作物耐鹽性的研究結果類似。根據(jù)試驗結果高粱各性狀在 25 mmol·L-1和 50 mmol·L-1脅迫下差異顯著，都可以作為篩選濃度，但是考慮到低濃度堿性鹽的鹽堿地在實際中很難遇到，因此選擇50 mmol·L-1脅迫濃度鑒定高粱親本系。這也是與李豐先等［12］篩選高粱雜交種的濃度不一樣的原因之一，其次是培養(yǎng)環(huán)境不同，該研究培養(yǎng)環(huán)境是12 h 光照和12 h 黑暗，本研究種子萌發(fā)培養(yǎng)環(huán)境為24 h 黑暗處理，具體的遺傳效應和生理機制還需進一步研究。

鹽堿脅迫后植物的多種萌發(fā)性狀變化直接反映了鹽害程度［27］。單一的性狀評價作物耐鹽堿特性具有一定的局限性，且作物耐鹽堿性是基因和環(huán)境互作的多種萌發(fā)性狀的綜合表現(xiàn)［28］。因此選取有代表性的指標，建立客觀的評價體系，對高粱品種萌發(fā)期耐堿的評價和大批量篩選耐堿種質和雜交種至關重要。前人以平均隸屬函數(shù)值法對性狀的相對值進行耐堿排序，再通過聚類分析進行耐堿分級［29，30］。但聚類分析在樣本量較大時，獲得聚類結論有一定困難，本研究根據(jù)平均隸屬函數(shù)值的大小范圍進行耐堿級別劃分，把146 份粒用高粱親本系劃分為強耐堿、耐堿、中等耐堿、堿敏感、堿極敏感，共5 個耐堿級別。同時，本研究選取了相對發(fā)芽勢等11 個性狀對高粱的萌發(fā)期耐堿進行綜合評價，相關分析表明，這些鑒定指標之間存在顯著和極顯著的相關性，我們采用因子分析，通過對多項指標進行降維處理，篩選到3 個主成分可代表不同處理間變異的全部信息，其中相對中胚軸長、相對葉鮮重、相對根鮮重分別在3 個主成分中載荷最大。為了進一步證明3 個指標可以作為耐堿性的鑒定指標，我們計算了這3 個性狀的平均隸屬函數(shù)值S1，與S 值進行比較分析，確定了相對中胚軸長、相對芽鮮重、相對根鮮重這3 個指標作為評價粒用高粱萌發(fā)期耐堿性的主要鑒定指標。