陳洪明 唐小雪 林雅瀅 龔玄清 林泓域 高錦豪

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系，譜學(xué)分析與儀器教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361005)

0 引 言

鈣離子對幾乎所有細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都必不可少，參與從胚胎發(fā)生到神經(jīng)功能的各個生命過程[1]。動物體液和組織中的總鈣濃度為2.1～2.6 mmol·L-1[2]，以自由離子、有機(jī)配合物和無機(jī)物小分子3種形式存在[3]。由于自身的電荷、離子半徑、可極化性等特性，Ca2+具有從6到12的靈活的配位數(shù)。特殊的配位能力使得生物體可以通過有機(jī)小分子配體和對Ca2+具有強(qiáng)親和力配位位點(diǎn)的蛋白來調(diào)控不同形式的Ca2+在生物體內(nèi)不同時空區(qū)域的濃度及比例，以發(fā)揮Ca2+信號傳遞作用。細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+濃度通?？梢员燃?xì)胞外低4個數(shù)量級[4]。Ca2+作為信號載體參與調(diào)控細(xì)胞行使各種生理功能的過程，但其濃度平衡被打破則會產(chǎn)生毒性并導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。腦血管疾病導(dǎo)致的死亡占全世界所有死亡人數(shù)的9.6%，而局域腦缺血情況的檢測和監(jiān)控對臨床診斷和治療腦血管疾病具有重要意義[5-6]。缺血腦區(qū)的葡萄糖氧化會被嚴(yán)重影響，導(dǎo)致三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)不能正常產(chǎn)生，引發(fā)一系列有害的生化生理過程。例如，局域Ca2+平衡會被嚴(yán)重破壞而導(dǎo)致細(xì)胞急性或慢性死亡[7]。腦缺血時，局域的細(xì)胞外Ca2+濃度會急劇下降，臨床上可以通過及時灌注來重新建立Ca2+的平衡達(dá)到治療效果[8]。因此，Ca2+在生命體內(nèi)分布的活體原位成像分析對生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)具有重要意義。

雖然熒光方法在細(xì)胞層面可以很好地分析檢測Ca2+信息，但其有限的生物組織穿透深度嚴(yán)重限制了其實(shí)際應(yīng)用。磁共振成像 (magnetic resonance imaging，MRI)是一種臨床廣泛使用的有效生物成像技術(shù)，具有軟組織高分辨率，非介入，無電離輻射，不受穿透深度限制等優(yōu)點(diǎn)。為了獲得更準(zhǔn)確的成像信息，臨床上常需要造影劑輔助。雖然具有功能性響應(yīng)的1H MRI造影劑被廣泛研究[9-12]，其中也有一些金屬離子檢測的報道[13]，但人體內(nèi)存在大量的水，1H MRI的背景干擾嚴(yán)重。19F核具有低生物背景、寬化學(xué)位移和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，因此在生物活性小分子檢測方面19F MRI具有一定優(yōu)勢[14]。近年來，構(gòu)建19F MRI探針檢測生物標(biāo)志物的報道也逐漸增加[15-19]。檢測金屬離子的19F MRI研究也有一些報道，但仍有一些問題需要克服，例如，檢測Ca2+的探針存在信號單一或非陽性信號響應(yīng)等問題[20-21]。另一方面，目前臨床使用的1H MRI造影劑主要基于Gd3+，其毒性等問題未能完全克服[9，22]，因而基于 Mn2+的1H MRI造影劑的開發(fā)近來已引起科學(xué)家的重視[23-24]。我們把19F引入到對Ca2+有強(qiáng)親和力[25]的小分子配體的結(jié)構(gòu)中，利用順磁性Mn2+對19F的偶極相互作用，即順磁弛豫增強(qiáng)(paramagnetic relaxation enhancement，PRE)效應(yīng)，調(diào)控19F MRI信號，水配位數(shù)調(diào)控Mn2+對1H MRI造影效果[26]，從而通過競爭配位策略，構(gòu)建了對Ca2+離子實(shí)現(xiàn)特異性陽性信號響應(yīng)的1H/19F MRI分子探針 Mn（Ⅱ）-L(1)(圖 1)。

圖1 探針1對Ca2+響應(yīng)的示意圖Fig.1 Schematic illustration showing the response of probe 1 to Ca2+

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

AvanceⅢ500 MHz NMR譜儀(布魯克公司，合成實(shí)驗(yàn)的NMR表征)；AvanceⅢ 600 MHz NMR譜儀(布魯克公司，探針響應(yīng)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)測試)；紐邁0.5 T NMI20 Analyst系統(tǒng) (0.5 T弛豫率測試和1H MRI)；9.4 T BioSpec MRI系統(tǒng) (布魯克公司，9.4 T19F MRI)；Esquire 3000 Plus 質(zhì)譜儀(布魯克公司)；高效液相色譜系統(tǒng)(島津公司，產(chǎn)物分離純化)，色譜柱(Waters公司，XBridge Prep C18 5 μm OBD 19 mm×250 mm；總流速：10 mL·min-1)。 所用溶劑均為分析純市售國藥；反應(yīng)試劑購買于伊諾凱、百靈威、阿拉丁和阿爾法公司，純度均不低于97%。

1.2 化合物的合成及表征

探針Mn（Ⅱ）-L(1)合成路線示意圖如圖2所示。

化合物3的合成：在圓底燒瓶中將2，2，2-三氟乙胺(2.5 g，25 mmol)溶解于 60 mL CHCl3，加入 20 mL K2CO3水溶液(5.2 g，38 mmol)，反口塞密封并插N2氣球，用低溫反應(yīng)釜將溶液冷卻到5℃。在攪拌下把20 mL溴乙酰溴的CHCl3溶液(7.5 g，38 mmol)于30 min內(nèi)滴加到上述兩相溶液中，把反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到室溫繼續(xù)攪拌15 h。除去水相，有機(jī)相用飽和NaHCO3水溶液洗1次，再用純水洗3次，無水Na2SO4干燥后旋蒸得白色固體產(chǎn)品3(2.4 g，87%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 4.00～3.90(m，4H)，6.83(1H，NH)；19F NMR(470 M，CDCl3)：δ-72.41(s)。

化合物 4 的合成：將 2，2′-(亞乙基二氧)雙(乙胺)(0.75 g，5 mmol)溶解于30 mL甲醇，室溫下滴加入苯甲醛(1.3 g，12 mmol)后，于65℃攪拌回流5 h。冷卻到室溫后分多次加入NaBH4(1.5 g，40 mmol)，繼續(xù)攪拌5 h后旋蒸除去溶劑。用二氯甲烷(dichloromethane，DCM)溶解，水洗3次，旋蒸除去溶劑。DCM和MeOH(體積比為 100∶1～100∶7)過硅膠柱純化得淺黃色油狀液體產(chǎn)品4(1.8 g，82%)：1H NMR(500 MHz，CD3OD)：δ 7.20～7.34(m，10H，Ar-H)，3.74(s，4H，Ar-CH2)，3.56～3.60(m，8H，CH2OCH2)，2.73(t，J=5 Hz，4H，NCH2)；ESI-MS(m/z)C20H28N2O2理論值(M+H)+328.2，測得 329.6。

化合物5的合成：在圓底燒瓶中將4(1.0 g，3 mmol)溶解于 40 mL DCM，加入N，N-二異丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine，DIPEA)(1.3 g，10 mmol)，反口塞密封并插N2氣球，用低溫反應(yīng)釜將溶液冷卻到-20℃。在攪拌下把10 mL溴乙酸叔丁酯的DCM溶液(1.28 g，6.6 mmol)于1 h內(nèi)滴加到反應(yīng)液中，把反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到室溫繼續(xù)攪拌20 h。水洗3次后旋蒸除去溶劑。MeOH和DCM(體積比值為0～1/100)過硅膠柱純化得無色油狀液體產(chǎn)品5(1.3 g，78%)：1H NMR(500 MHz，CD3OD)：δ 7.18～7.35(m，10H，Ar-H)，3.79(s，4H，Ar-CH2)，3.58(t，J=5.5 Hz，4H，CH2O)，3.55(s，4H，OCH2CH2O)，3.27(s，4H，CH2COO)，2.85(t，J=6.0 Hz，4H，NCH2)，1.45(s，18H，C(CH3)3)；ESI-MS(m/z)C32H48N2O6理論值(M+H)+557.4，測得 557.5。

圖2 探針1合成路線示意圖Fig.2 Schematic illustration showing the synthesis of probe 1

化合物6的合成：將5(1.12 g，2 mmol)和甲酸銨(0.63 g，10 mmol)溶于60 mL甲醇，加入10%的鈀碳(1.0 g)后于65℃攪拌回流5 h。冷卻到室溫后用硅藻土過濾，濾液旋蒸除去溶劑后用DCM溶解并水洗3次，無水Na2SO4干燥后旋蒸得油狀液體產(chǎn)品6(0.65 g，86%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 3.61(s，4H，OCH2CH2O)，3.58(t，J=6.5 Hz，4H，CH2O)，3.31(s，4H，CH2COO)，2.78(t，J=6.5 Hz，4H，NCH2)，1.45(s，18H，C(CH3)3)；ESI-MS(m/z)：C18H36N2O6理論值(M+H)+377.3，測得377.7。

化合物7的合成：在圓底燒瓶中將6(0.65 g，2 mmol)和 DIPEA(1.2 g，4 mmol)溶于 60 mL DCM。 反口塞密封并插N2氣球，冷卻到-20℃，滴加入10 mL 3(1.1 g，2.4 mmol)的DCM溶液，反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到室溫繼續(xù)攪拌16 h。旋蒸除溶劑后用DCM溶解，再水洗3次，有機(jī)相用無水Na2SO4干燥，旋蒸除去溶劑，過硅膠柱純化得白色固體產(chǎn)品7(0.82 g，73%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 3.87～3.94(m，4H，CF3CH2)，3.56(s，4H，OCH2CH2O)，3.51(t，J=5.0 Hz，4H，CH2O)，3.39(s，4H，CH2COO)，3.35(s，4H，CH2COO)，2.87(t，J=5 Hz，4H，NCH2)，1.45(s，18H，C(CH3)3)；19F NMR(470 MHz，CDCl3)：δ-72.28；ESI-MS(m/z)C26H45F6N4O8理論值(M+H)+655.3，測得655.3。

化合物8的合成：將 7(0.65 g，1 mmol)溶于 10 mL乙酸，加入10 mL 36%(w/w)濃鹽酸，室溫攪拌10 h后旋蒸除去溶劑。以水/乙腈為淋洗劑過高效液相色譜(HPLC)純化得白色固體產(chǎn)品 8(0.45 g，82%)：1H NMR(500 MHz，CD3OD)：δ 3.93～3.98(m，4H，CF3CH2)，3.65(t，J=5.0 Hz，4H，CH2O)，3.63(s，4H，OCH2CH2O)，3.60(s，8H，OOCCH2CH2COO)，3.05(t，J=5 Hz，4H，NCH2)；19F NMR (470 MHz，CDCl3)：δ-73.73；ESI-MS(m/z)C18H28F6N4O8理論值(M+H)+543.2，測得 543.3。

探針 1的合成：將 8(0.2 g，0.37 mmol)溶于 20 mL水中，用1 mmol·L-1NaOH溶液把pH值調(diào)到7.5。 加入MnCl2·4H2O(88 mg，0.45 mmol)， 用稀NaOH溶液(0.1 mmol·L-1)緩慢調(diào)節(jié)pH值到7，攪拌30 min后過HPLC純化(水/甲醇為淋洗劑)，凍干得白色固體產(chǎn)品 1(0.17 g，76%)：19F NMR(564 MHz，D2O)：δ-67.2(嚴(yán)重展寬)；ESI-MS(m/z)C18H26F6MnN4O8理論值(M+H)+595.4，測得596.0。

1.3 探針對Ca2+響應(yīng)的T2性質(zhì)測試

相同濃度的探針1(1 mmol·L-1)分別與不同濃度CaCl2在Tris緩沖液(pH=7.4)中進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)不同時間點(diǎn)分別測其1H的T2值(0.5 T)。

1.4 探針對Ca2+響應(yīng)的19F NMR和1H MRI性質(zhì)測試

相同濃度探針1(1 mmol·L-1)分別與不同濃度CaCl2在Tris緩沖液(pH=7.4)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時間均為30 min，反應(yīng)后分別測其19F NMR(14.1 T，564 MHz)譜和1H MRI(0.5 T)。

1.5 探針響應(yīng)前后弛豫率r1的變化及1H MRI測試

探針 1(1 mmol·L-1)及其與 CaCl2(5 mmol·L-1)在Tris緩沖液(pH=7.4)中反應(yīng)后分別逐級稀釋后測1H的T1值及 MRI(0.5 T)；不同濃度的探針與5 mmol·L-1探針反應(yīng)后測1H MRI(0.5 T)。

1.6 探針選擇性測試

探針1(1 mmol·L-1)與不同金屬離子在Tris緩沖液 (pH=7.4)中反應(yīng)30 min后分別測反應(yīng)液的19F NMR 譜(14.1 T，564 MHz)和1H 的 T1值(0.5 T)。

1.7 探針對Ca2+響應(yīng)的19F MRI性質(zhì)測試

探針 1(5 mmol·L-1)與不同濃度 CaCl2在 Tris緩沖液中反應(yīng)后在進(jìn)行19F MRI測試(9.4 T)。

1.8 探針對血清和血漿中Ca2+響應(yīng)的19F NMR測試

向用生理鹽水稀釋10倍的小鼠血清和血漿中加入探針 1(終濃度為 0.1 mmol·L-1)和 10%(V/V)的D2O，反應(yīng)后進(jìn)行19F NMR測試(14.1 T，564 MHz)。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針1對Ca2+響應(yīng)的1H的T2性質(zhì)測試

相同濃度探針1分別與不同濃度Ca2+反應(yīng)，其反應(yīng)液1H的T2均1 min達(dá)到恒定值，表明Ca2+對Mn2+的取代反應(yīng)都很快就能完成(圖S1)。其中，T2是指橫向弛豫時間，是施加90°脈沖后橫向磁化矢量衰減到37%所需要的時間。同時，反應(yīng)后的T2隨Ca2+濃度的增加而變短 (圖3a)，表明有更多Mn2+被Ca2+從配體上取代而變?yōu)橛坞x態(tài)。當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到探針的10倍時，T2不再隨Ca2+濃度增加而變化，表明此時Mn2+基本都被取代而變?yōu)橛坞x態(tài)。因此，通過1H的T2值表征可知，Ca2+對Mn2+的取代反應(yīng)動力學(xué)很快，探針能實(shí)現(xiàn)快速響應(yīng)，且Ca2+濃度為探針5倍時，大部分探針已經(jīng)反應(yīng)完成。ESI-MS表征的分子量在與Ca2+反應(yīng)后從596.0變?yōu)?81.0，進(jìn)一步確認(rèn)了探針中的Mn2+被Ca2+所取代(圖S2)。

圖3 通過(a)1H的T2變化和(b)19F NMR表征1 mmol·L-1探針1對不同濃度Ca2+的響應(yīng);(c)為(b)相應(yīng)的信噪比曲線(對應(yīng)-72.1的峰)Fig.3 Response of probe 1(1 mmol·L-1)to Ca2+with different concentrations based on(a)T2of1H and(b)19F NMR;(c)Corresponding SNRs of the peak at-72.1 in(b)

2.2 探針1對Ca2+響應(yīng)的19F NMR性質(zhì)測試

通過前面的T2性質(zhì)表征得到了探針1對Ca2+響應(yīng)的時間和濃度參數(shù)，我們進(jìn)一步測試了其19F NMR信號的響應(yīng)情況。如圖1和圖3(b，c)所示，探針1的19F NNR譜圖中，由于順磁性Mn2+的近距離順磁弛豫增強(qiáng)(paramagnetic relaxation enhancement，PRE)作用導(dǎo)致19F核的T2從680 ms急劇縮短到1 ms以下，從而引起譜峰嚴(yán)重展寬。當(dāng)加入Ca2+后，在-72.1位置出現(xiàn)了尖銳的譜峰，且譜峰的信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)隨著 Ca2+濃度的增加而增加，其變化趨勢與T2性質(zhì)一致。因此，該探針對Ca2+具有很好的19F NMR信號響應(yīng)。

2.3 探針1響應(yīng)前后弛豫率r1的變化及1H MRI測試

根據(jù) Solomon-Bloembergen-Morgan(SBM)理論[26]，當(dāng)探針中的Mn2+被Ca2+取代后變?yōu)橛坞x態(tài)時，Mn2+的水配位數(shù)變大，其對水中1H的縱向弛豫率r1也會變大。為了獲得探針1在響應(yīng)前后其r1變化的定量結(jié)果，我們分別測試了0.5 T場強(qiáng)下探針自身及探針(1 mmol·L-1)與 Ca2+(5 mmol·L-1)反應(yīng)后的 r1值(如圖 4a)。 結(jié)果顯示，探針的 r1為 2.68 mmol·L-1·s-1，與5倍物質(zhì)的量的Ca2+反應(yīng)后，其r1變?yōu)?6.26 mmol·L-1·s-1，增加了 1 倍多。圖 4b 所示為不同濃度的探針與5 mmol·L-1的Ca2+反應(yīng)前后的T1權(quán)重1H MRI。其中，T1是指縱向弛豫時間，是施加90°脈沖后縱向磁化矢量恢復(fù)到63%所需要的時間。結(jié)果也顯示探針與Ca2+反應(yīng)后，其信號都有不同程度的變亮，表明探針響應(yīng)后，其r1變大。因此，該探針對Ca2+具有很好的1H MRI信號響應(yīng)。

圖4 探針響應(yīng)前后的弛豫率(a)r1及(b)1H MRI表征Fig.4 (a)r1 and(b)1H MRI of probe 1 before and after responding to Ca2+

2.4 探針1選擇性測試

選擇性是一個探針的重要性質(zhì)，所以我們在研究了響應(yīng)性質(zhì)后進(jìn)一步對探針1選擇性進(jìn)行研究。如圖5(a，b)所示，我們通過19F NMR信號和1H的T1兩個參數(shù)的測試研究了體內(nèi)存在的Na+、K+、Mg2+、Zn2+幾種金屬離子對探針檢測Ca2+的干擾。結(jié)果顯示，探針1對Ca2+的響應(yīng)具有很好的選擇性。

圖5 利用(a)19F NMR和(b)1H的T1表征探針1(1 mmol·L-1)的選擇性Fig.5 Selectivity of probe 1(1 mmol·L-1)characterized by(a)19F NMR and(b)T1 of1H

2.5 探針1對Ca2+響應(yīng)的1H MRI(0.5 T)和19F MRI(9.4 T)性質(zhì)測試

我們進(jìn)一步研究了0.5 T下1 mmol·L-1探針1與不同濃度Ca2+響應(yīng)后T1權(quán)重的1H MRI(圖6a)。結(jié)果顯示，隨著Ca2+濃度的增加，1H MRI信號逐漸變亮，表明Mn2+變?yōu)橛坞x態(tài)后，其r1變大。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前r1測試結(jié)果一致。而19F MRI的結(jié)果則如圖6b所示，由于19F與探針中順磁性Mn2+的距離很近，強(qiáng)烈的PRE作用使得19F的T2急劇縮短，探針本身的19F MRI信號基本測不到。隨著Ca2+濃度的增加，在化學(xué)位移-72.1處的19F MRI信號逐漸變亮，與19F NMR信號變化(圖3)一致，表明該探針對Ca2+具有很好的19F MRI信號響應(yīng)。

圖6 探針1對不同濃度Ca2+響應(yīng)的1H/19F MRI測試:(a)1 mmol·L-1探針 1與不同濃度 Ca2+反應(yīng)的1H MRI表征(0.5 T);(b)5 mmol·L-1探針 1 與不同濃度Ca2+反應(yīng)的19F MRI(9.4 T)表征Fig.6 (a)1H MRI(0.5 T)of 1 mmol·L-1probe 1 and(b)19F MRI(9.4 T)of 5 mmol·L-1probe 1 in response to Ca2+with different concentrations

2.6 探針對血清和血漿中Ca2+響應(yīng)的19F NMR測試

基于以上對探針性質(zhì)的研究，我們初步研究了探針對鼠血清和血漿中Ca2+響應(yīng)情況。如圖7所示，探針分別與血清和血漿作用后，化學(xué)位移-72.1處的19F NMR信號都得到顯著恢復(fù)。因此，該探針對血液中的Ca2+具有很好的19F NMR信號響應(yīng)。

圖7 0.1 mmol·L-1探針1對稀釋10倍的小鼠血漿和血清響應(yīng)的19F NMR表征Fig.7 Response of 0.1 mmol·L-1probe 1 to the blood plasma and serum(diluted by 10 folds)of mice characterized by19F NMR

3 結(jié) 論

含19F的小分子配合物探針Mn（Ⅱ）-L(1)中的順磁性Mn2+能通過PRE效應(yīng)強(qiáng)烈縮短19F弛豫時間T2，從而有效降低19F磁共振信號。生理pH值條件下，Ca2+能通過競爭配位特異性地與探針1快速反應(yīng)，將Mn2+從探針中取代下來。Mn2+被取代后變?yōu)橛坞xMn2+而遠(yuǎn)離19F，19F弛豫時間恢復(fù)變長，其磁共振信號(NMR/MRI)得到恢復(fù)。同時，Mn2+由配合態(tài)變?yōu)橛坞x態(tài)，其水配位數(shù)增加，對水的1H弛豫率r1顯著變大，從而在探針對Ca2+響應(yīng)后1H MRI信號顯著變化。因此，Mn（Ⅱ）-L能通過19F NMR/MRI和1H MRI多重信號變化同時實(shí)現(xiàn)對Ca2+的特異性檢測。探針1對血漿和血清中Ca2+的成功響應(yīng)，顯示出該探針在活體19F MRI檢測Ca2+中的良好潛力。

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