王小波 熊惠娟 吳莎莎 耿志榮 王志林

(1湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，咸寧 437100)

(2南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，配位化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

0 引 言

熒光探針技術(shù)是基于熒光信號的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)換和識別的分析檢測手段，它相比于高效液相色譜法、電化學(xué)分析法等，具有選擇性高、檢測限低、能實(shí)現(xiàn)原位檢測、實(shí)時跟蹤監(jiān)測和不需復(fù)雜的前處理工序等優(yōu)點(diǎn)。熒光探針概念的提出最早可追溯到1977年，密歇根州立大學(xué)的Sousa首次報(bào)道了2個基于萘環(huán)-冠醚體系的化合物，當(dāng)堿金屬離子與其相互作用時，熒光發(fā)生了顯著的淬滅或增強(qiáng)現(xiàn)象[1]。隨后，De Silva于1986年引入了“熒光開關(guān)”這一新的表述方式[2]。直至1994年，Czarnik明確提出了熒光探針的構(gòu)成三要素，即識別基團(tuán)(receptor)、熒光信號基團(tuán)(fluorophore)及連接臂(spacer)[3](圖1)。在熒光信號基團(tuán)-連接臂-識別基團(tuán)這一經(jīng)典模型的指導(dǎo)下，針對各種目標(biāo)底物的熒光探針不斷涌現(xiàn)，其中不乏一些高選擇性、高靈敏性的探針分子，已被廣泛應(yīng)用于生化檢測、食品藥品監(jiān)控與分析、臨床疾病篩查、環(huán)境監(jiān)測等各項(xiàng)領(lǐng)域[4-9]。

圖1 熒光探針的基本構(gòu)成示意圖Fig.1 Basic composition of fluorescent probes

熒光探針的分類方法較多，粗略地按制備方法可分為有機(jī)小分子探針、納米熒光探針和基因熒光探針3類。常見的如依據(jù)機(jī)理的不同可分為：(1)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移 (PET)[10]；(2)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)[11]；(3)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移 (ICT)[12]；(4)激基締合物的形成或消失(Monomer-Excimer)[13]；(5)激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移 (ESIPT)[14]；(6)聚集誘導(dǎo)發(fā)光 (AIE)[15]等。另外，根據(jù)檢測的目標(biāo)底物的不同可細(xì)分為pH探針、金屬離子探針、陰離子探針、活性氧(ROS)探針、生物活性分子探針、細(xì)胞器探針、微環(huán)境探針等。大環(huán)多胺的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為環(huán)形空腔和含有較多(通常3個以上)擁有孤對電子的N原子，因此它能與H+、金屬離子等的空軌道作用，從而影響或改變分子中電子的傳遞、或改變自身的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而通過熒光光譜的改變反映出對底物的識別過程。進(jìn)一步地，大環(huán)多胺與金屬離子形成配合物后，可與陰離子、生物分子、DNA、RNA等相互作用，發(fā)生特異性結(jié)合。此外，由于較多N原子的存在，引入連接臂和各種熒光團(tuán)或進(jìn)行其他結(jié)構(gòu)修飾(功能化)則顯得尤其方便。由此可知，大環(huán)多胺作為直接或間接識別基團(tuán)，在構(gòu)筑熒光探針方面具有其獨(dú)特的“天賦”優(yōu)勢。

隨著熒光分析技術(shù)的進(jìn)步與儀器靈敏性的不斷升級，相信大環(huán)多胺型熒光探針分子庫將會進(jìn)一步發(fā)展和豐富，并在化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境等諸多領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。本文將通過檢測底物的不同來進(jìn)行分類，就近年來基于大環(huán)多胺的熒光探針進(jìn)行綜述總結(jié)。代表性的大環(huán)多胺有四氮環(huán)cyclen、cyclam、pyclen，及三氮環(huán) tacn 等，其結(jié)構(gòu)如表1。

表1 常見大環(huán)多胺的結(jié)構(gòu)與基本信息Table 1 Structures and basic information of the common macrocyclic polyamines

1 生命體系富含的金屬離子探針

K+、Na+、Ca2+是生命體系中最豐富的金屬離子，此外，一些微量的過渡金屬離子如Zn2+、Cu2+、Fe3+、Fe2+等也在人體的各項(xiàng)生理活動和新陳代謝中發(fā)揮著舉足輕重的作用。在所有基于大環(huán)多胺熒光探針的報(bào)道中，關(guān)于這些離子的文獻(xiàn)數(shù)量占比也是最大的。Abir等[30]在cyclam上引入單一的亞甲基苯并咪唑作為熒光團(tuán)，合成得到了一個“OFF-ON”型Zn2+探針1。該探針對Zn2+有良好的選擇性，而Cu2+則淬滅其熒光。當(dāng)向探針1的溶液中逐漸加入Zn2+時，熒光強(qiáng)度(λem=304 nm)隨Zn2+濃度的增加而線性升高，最終可達(dá)到起始強(qiáng)度的12倍，熒光量子產(chǎn)率則從0.02增加至0.2。其熒光增強(qiáng)機(jī)理為Zn2+通過與環(huán)上的N配位，阻礙了PET過程的發(fā)生，并有效促進(jìn)了螯合增強(qiáng)熒光效應(yīng)(CHEF)。與其結(jié)構(gòu)類似，區(qū)別僅在于識別基團(tuán)為cyclen的化合物2，在Zn2+傳感上則遠(yuǎn)不及1，其原因可能為在構(gòu)筑探針方面，cyclam相比于cyclen具有更好的CHEF效果[31]。

Shiraishi等[32]報(bào)道了一個苯基苯并惡唑-酰胺-cyclen型的比例型Zn2+熒光探針3。該探針?biāo)苄粤己?，發(fā)射峰位于383 nm處，當(dāng)向其中加入Zn2+時，該發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸下降，而在445 nm處出現(xiàn)一個新的發(fā)射峰，并隨Zn2+濃度的增加而增加，而其他金屬離子均無此現(xiàn)象。通過測量該化合物加入Zn2+前后的IR光譜和電勢滴定數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Zn2+除與cyclen上4個氮原子配位外，還與酰胺鍵中的O發(fā)生了強(qiáng)烈的配位作用，并導(dǎo)致酰胺鍵中-NH-的去質(zhì)子化，于是產(chǎn)生了新的熒光發(fā)射峰(445 nm)。從頭計(jì)算表明，去質(zhì)子化使得苯并惡唑單元在處于激發(fā)態(tài)時可以自由旋轉(zhuǎn)，進(jìn)而穩(wěn)定了TICT激發(fā)態(tài)。

Comby等[33]制備了一個基于Yb（Ⅲ）-cyclen-8-羥基喹啉體系的新型Zn2+探針4。此化合物通過配位非飽和的Yb（Ⅲ）前體配合物5與磺酸化的8-羥基喹啉在溶液中自組裝而得。在磺酸化8-羥基喹啉“天線效應(yīng)”的作用下，探針4在近紅外區(qū)表現(xiàn)出較高的熒光量子產(chǎn)率(甲苯，Q=(0.23±0.03)%)。其對Zn2+的傳感機(jī)理為，加入的Zn2+的與磺酸化的8-羥基喹啉結(jié)合形成了更為穩(wěn)定的復(fù)合物，產(chǎn)生了該復(fù)合物的特征綠色熒光(λem=529 nm)，而由于4的“天線”被奪走，起初的近紅外熒光發(fā)射峰 (Yb3+：2F5/2→2F7/2，λem=984 nm)則消失。由此可知，探針4能同時在近紅外區(qū)和可見光區(qū)實(shí)現(xiàn)對Zn2+的高效檢測，且EDTA滴定實(shí)驗(yàn)表明其對Zn2+的熒光響應(yīng)具有可逆性。事實(shí)上，Yb（Ⅲ）前體配合物5也能通過熒光淬滅實(shí)現(xiàn)對Zn2+的檢測。

化合物6是趙玉芬等[34]報(bào)道的一個以羅丹明為熒光團(tuán)，酰胺鍵為連接臂，cyclen為識別基團(tuán)的Cu2+熒光探針。它具有較高的選擇性和靈敏性，可實(shí)現(xiàn)對Cu2+的裸眼識別，向6的溶液中加入Cu2+，溶液由無色變?yōu)榉凵Ｗ贤饪梢娢展庾V顯示，當(dāng)體系中Cu2+的量為6的2倍時，557 nm處的吸光度達(dá)到最大值，增加了71倍，工作曲線也進(jìn)一步表明6與Cu2+的結(jié)合比為1∶2。熒光光譜發(fā)現(xiàn)Cu2+可使580 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度提高53倍，是一個并不多見的“OFF-ON”型Cu2+探針，通過計(jì)算可得其對Cu2+的檢測限為 2 μmol·L-1。

圖2 探針1～5的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of fluorescent probes 1～5

圖3 探針6～10的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of fluorescent probes 6～10

Watkinson 等[35]在 1，8-萘二酰亞胺的基礎(chǔ)上，通過雙點(diǎn)擊反應(yīng)，引入cyclam作為識別基團(tuán)和生物素作為癌細(xì)胞靶向基團(tuán)，成功合成出水溶性良好的化合物7。熒光滴定實(shí)驗(yàn)和競爭性實(shí)驗(yàn)表明7是一個優(yōu)良的Zn2+增強(qiáng)型探針，同時它具有很低的細(xì)胞毒性。在激光共聚焦顯微鏡下，通過與DAPI對比染色發(fā)現(xiàn)，探針7能透過細(xì)胞膜并進(jìn)入MCF-7細(xì)胞核內(nèi)，而在核外幾乎未見分布。當(dāng)向培養(yǎng)基中加入外源性鋅補(bǔ)充劑吡啶硫酮鋅后，細(xì)胞核內(nèi)及核外熒光均顯著增強(qiáng)。繼續(xù)加入鋅螯合劑TPEN孵育后，整個細(xì)胞內(nèi)的熒光則明顯減弱。當(dāng)以正常N-TERT角質(zhì)細(xì)胞來重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)時，發(fā)現(xiàn)即使加入足量的吡啶硫酮鋅，也無法觀察到明顯的熒光。由此可知探針7具有良好的癌細(xì)胞靶向性，可用于癌細(xì)胞中Zn2+的熒光成像，這為研究Zn2+在細(xì)胞癌變及癌癥演化過程中的作用提供了有力武器。

Pierre課題組[36]報(bào)道了一個K+探針8，它以氮雜冠醚同時作為識別基團(tuán)和連接基團(tuán)，連接5H-色烯并[2，3-b]吡啶-5-酮作為天線。沒有K+加入時，天線處于遠(yuǎn)端，熒光很弱，當(dāng)加入K+，冠醚與K+配位，pπ共軛拉近了天線和金屬中心Tb3+的距離，使得能量可以從天線傳遞到Tb3+，實(shí)現(xiàn)了對K+的熒光傳感。該分子是一個優(yōu)良的時間門控型傳感器，對K+的結(jié)合常數(shù)為0.33 L·μmol-1。它對K+的選擇性相對于常見競爭性離子如 Na+、Li+、Mg2+與 Ca2+等，分別達(dá)到93、260、105和61倍。因此探針8非常有希望作為臨床 K+(0～10 mmol·L-1)的檢測分析工具。

林偉英等[37]在cyclam環(huán)上引入三碳花青染料作為長波長熒光團(tuán)，制備得到了一個比例型的近紅外Cu2+熒光探針9，其2組發(fā)射峰分別位于637 nm(近紅外區(qū))與 778 nm(遠(yuǎn)紅外區(qū))，相差達(dá) 142 nm。該探針對Cu2+的響應(yīng)快，靈敏度高，檢測限低至8.9×10-8mol·L-1，成功應(yīng)用于SMMC7721細(xì)胞和昆明小鼠體內(nèi)對Cu2+的熒光成像。

王志林等[38]在pyclen環(huán)上連接單個NBD懸臂合成了一個 “ON-OFF”型Cu2+熒光探針10。只有Cu2+能有效淬滅10的熒光，即使在遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的Na+、Ca2+、Mg2+存在下也不影響對Cu2+的檢測。同時，該探針能選擇性定位于細(xì)胞的溶酶體，因而可適用于亞細(xì)胞層面對溶酶體中Cu2+的分析及成像，這將有助于理解溶酶體中Cu2+的功能及相關(guān)疾病如威爾遜病、門克斯綜合征、阿爾茲海默氏癥等。

2 重金屬離子探針

電子產(chǎn)品的普及和較低的回收利用率使得重金屬離子如Pb2+、Hg2+、Cd2+等的污染廣泛存在，它們在人體內(nèi)富集到一定程度會對各器官造成嚴(yán)重傷害，制備針對上述重金屬離子的高選擇性和靈敏性探針具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?；诖蟓h(huán)多胺的重金屬離子熒光探針也有較多文獻(xiàn)報(bào)道。蘭靜波等[39]合成了2個基于雙cyclen為識別基團(tuán)和苝酰亞胺為熒光團(tuán)的化合物11與12。Pb2+的加入能顯著提高它們在548 nm發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度，在其他金屬離子的競爭干擾下，12比11具有更突出的Pb2+選擇性與靈敏性。由于11中含有一頭一尾2個cyclen環(huán)，呈對稱結(jié)構(gòu)，而12中只一端為cyclen，另一端為親脂性的n-C8H17，所以探針11具有更好的水溶性，其與Pb2+的結(jié)合比為 1∶2，12 與 Pb2+的結(jié)合比則為 1∶1。 鑒于12更好的親脂性，將其成功用于HepG2中對Pb2+的熒光成像。

余孝其等[40]在cyclen的基礎(chǔ)上，通過經(jīng)典的點(diǎn)擊化學(xué)手段，在對稱性的雙側(cè)或僅單側(cè)引入蒽環(huán)作為熒光團(tuán)制備得到了相應(yīng)的化合物13與14。雖然結(jié)構(gòu)相似，但這2個分子在金屬離子識別方面卻大相徑庭。擁有雙蒽環(huán)的13對Pb2+具有優(yōu)良的選擇性，Pb2+可使其熒光顯著增強(qiáng)，其他離子則對熒光無影響(Cu2+淬滅其熒光)。而對于單側(cè)蒽環(huán)的14，只有Hg2+及Cu2+能較大程度地淬滅其熒光，其他金屬離子無影響。其中Cu2+的“ON-OFF”效應(yīng)更為顯著，熒光幾乎完全淬滅。在 13濃度為 10 mmol·L-1的HEPES(pH 7.4，50 mmol·L-1)中，以 Pb(NO3)2溶液進(jìn)行熒光滴定，熒光強(qiáng)度與cPb2+在 0～10 μmol·L-1范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。隨后，作者成功將探針13用于對MDA-MB-231細(xì)胞中外源性Pb2+的熒光成像。為了考察探針13是否能在復(fù)雜生物樣品中也能對Pb2+進(jìn)行檢測，選取了胎牛血清作為對象，將Pb2+加入血清制備成特定濃度后進(jìn)行熒光滴定，結(jié)果表明其仍然對胎牛血清中的Pb2+具有良好的熒光響應(yīng)與線性關(guān)系。由此可知，13是一個極具前景的可用于復(fù)雜生物樣品中Pb2+定量檢測的熒光探針。

王志林課題組[41]利用pyclen連接丹磺酰氯為熒光團(tuán)，合成了一個水溶性良好的高靈敏性Hg2+熒光探針 15，檢測限達(dá)到 0.5 μg·L-1，低于美國環(huán)保局所要求的飲用水中汞的最高含量2 μg·L-1[42]。鑒于15與Hg2+作用十分迅速且肉眼可見顏色變化，將15涂覆于濾紙條上可做成試紙來方便快捷地檢測Hg2+含量。

Bazzicalupi等[43]報(bào)道了一系列以7-甲氧基-香豆素為熒光團(tuán)，含S的不同氮雜環(huán)為識別基團(tuán)的化合物16，17與18。在CH3CN/H2O混合溶液(4/1，V/V)中，此3個化合物均對Hg2+呈現(xiàn)熒光響應(yīng)，然后它們都可用于對Cos-7細(xì)胞中的Hg2+熒光成像。當(dāng)它們以Si@PEG納米材料包裹或負(fù)載于PVC聚合物薄膜上后，即可用于純水中對Hg2+的檢測。此外，作者將18均勻分散浸入到PVC薄膜中，并利用計(jì)算機(jī)屏幕照相輔助技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了對天然水樣品中的Hg2+定量分析。除了上述對Hg2+的共性響應(yīng)外，當(dāng)向化合物17的乙腈溶液中加入各種金屬離子時，唯有Al3+和Fe3+能使熒光急劇增強(qiáng)，表明17可用于對Al3+和Fe3+的分析檢測。

圖4 探針11～18的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of fluorescent probes 11～18

圖5 探針19～21的結(jié)構(gòu)Fig.5 Structures of fluorescent probes 19～21

Choi等[44]合成了2個以4-硝基-苯并呋咱(NBD)為熒光團(tuán)，cyclen為識別基團(tuán)的化合物19與20。其中化合物20對Hg2+、Cd2+及Pb2+均有不同程度的響應(yīng)而選擇性較差，化合物19則對Hg2+有優(yōu)異的選擇性。向乙酸/DMSO 緩沖液(1∶9，V/V，pH=4.8)中加入Hg2+，溶液顏色由起始的粉色變?yōu)辄S色，表明該探針能在酸性條件下實(shí)現(xiàn)對Hg2+的裸眼識別。當(dāng)cHg2+/c19達(dá)到100時，530 nm處熒光強(qiáng)度提高至原來的24.8倍。在上述酸性溶液中，探針19對Hg2+檢測限為 1.5 μmol·L-1。

Chang課題組[45]在cyclam環(huán)上同時引入NBD和苝環(huán)為兩組具有不同發(fā)射波長的熒光團(tuán)，制備得到了化合物21。游離的21分子在溶液中具有2個熒光發(fā)射峰，分別為385和538 nm，這是苝環(huán)和NBD的特征峰。對于Cu2+的熒光滴定，538 nm處發(fā)射峰強(qiáng)度明顯降低，而385 nm處基本沒有變化。當(dāng)向含有21的溶液中逐漸加入Hg2+時，538 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增加，最終可達(dá)起始值的10倍(此時cHg2+/c21=100)，而385 nm處的發(fā)射峰基本維持不變。這充分說明化合物21對于Hg2+和Cu2+而言，分別為“OFF-ON”型和“ON-OFF”型熒光探針，兼具檢測Hg2+和 Cu2+的功能。

3 鹵素陰離子與磷系物種探針

鹵素陰離子 X-(如 F-、Cl-、I-)與一些磷系物種如PPi、ATP、ADP、AMP 等在生命體系中扮演者不可替代的角色。大環(huán)多胺與金屬離子形成配合物后，可廣泛用于對X-及磷系物種的熒光傳感。Liu等[46]以C2對稱性的cyclen骨架為基礎(chǔ)，制備得到了一系列鑭系配合物 22～24(Ln=Eu，Tb，Yb)。 當(dāng)向它們的溶液加入F-后，F(xiàn)-會與兩分子中的Ln3+成鍵，并將2個配合物分子彼此拉近，形成一個近乎封閉的 “籠子”，F(xiàn)-自身則被包裹于“籠”中并占據(jù)中心位置。此超分子自組裝過程可由紫外可見吸收光譜、穩(wěn)態(tài)發(fā)射光譜、NMR與高分辨質(zhì)譜實(shí)施監(jiān)控。X-ray單晶衍射則進(jìn)一步揭示了“Eu-F-Eu”橋及Eu配合物二聚體的存在。Eu配合物對F-表現(xiàn)出優(yōu)良的選擇性，Eu3+特征熒光發(fā)射峰強(qiáng)度可提高22倍，而Cl-、Br-、AcO-與HCO3-均無響應(yīng)。表明Eu配合物22是一個優(yōu)異的F-探針，其對F-的檢測限可達(dá)0.46 μg·L-1(24 nmol·L-1)。

盧忠林課題組[47]以三氮環(huán)[12]aneN3為Cu2+識別基團(tuán)，BODIPY為熒光團(tuán)設(shè)計(jì)合成了一個含雙三氮環(huán)的“ON-OFF-ON”型Cu2+及ADP熒光探針25。Cu2+與25以2∶1的方式結(jié)合，且?guī)缀蹩赏耆銣?5的熒光。 當(dāng)繼續(xù)加入 ATP、ADP、AMP、PPi等各種磷系物種時，唯有ADP能使熒光完全恢復(fù)，它也被用于HepG2中外源性Cu2+及ADP的檢測。2018年，該團(tuán)隊(duì)[48]仍在[12]aneN3為Cu2+配位識別基團(tuán)的基礎(chǔ)上，以具有AIE活性的四苯基乙烯為核，制備了一個新的“ON-OFF-ON”型熒光探針26，可在水溶液中自組裝成AIE膠束，用于對Cu2+和ATP的熒光傳感。Cu2+能有效淬滅26的熒光，隨后加入ATP、ADP、AMP、GSH、Cys、Hcy及其它陰離子，只有 ATP 能讓熒光恢復(fù)(ADP不明顯)。該探針對Cu2+及ATP的檢測限分別為0.1和1.5 μmol·L-1。MTT實(shí)驗(yàn)表明26及26-Cu2+對細(xì)胞具有很低的細(xì)胞毒性和良好的細(xì)胞膜透過性，它們可成功用于HepG2細(xì)胞中對Cu2+與ATP的熒光成像。這也是第一例將AIE膠束用作界面熒光探針的報(bào)道。

王志林團(tuán)隊(duì)[49-50]以pyclen分別連接萘環(huán)和蒽環(huán)作為熒光團(tuán)合成得到了2個化合物27和28，當(dāng)加入Zn2+時，它們的熒光均顯著提高，是典型的“OFFON”型Zn2+熒光探針。與Zn2+結(jié)合形成相應(yīng)的復(fù)合物27-Zn（Ⅱ）和28-Zn（Ⅱ）后，都能對焦磷酸根(PPi)產(chǎn)生特異性的響應(yīng)，同時又有所不同。對于27-Zn（Ⅱ），加入PPi后在415 nm處產(chǎn)生了新的熒光峰，內(nèi)在原因是1個PPi與兩分子的27-Zn（Ⅱ）發(fā)生靜電相互作用，在PPi的牽引下形成了激基締合物。對于28-Zn（Ⅱ），PPi只是淬滅原體系的熒光。因此，27-Zn（Ⅱ）與28-Zn（Ⅱ）分別為比率型和 “ON-OFF”型PPi熒光探針。27-Zn（Ⅱ）成功用于檢測無機(jī)焦磷酸酶的活性，28-Zn（Ⅱ）則用于檢測堿性磷酸酶及ATP硫酸化酶的活性。

圖6 探針22～28的結(jié)構(gòu)Fig.6 Structures of fluorescent probes 22～28

4 重要功能性生物小分子探針

為了抵御外來應(yīng)激壓力與損傷，細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性小分子如GSH、Cys、Hcy扮演著“清道夫”的重要角色。此外，越來越多的研究表明，H2S、NO等作為內(nèi)源性氣體信號分子在調(diào)節(jié)血管舒張、神經(jīng)傳導(dǎo)、心肌收縮、細(xì)胞凋亡、炎癥等生理過程中具有十分重要的意義。因而設(shè)計(jì)研發(fā)針對上述重要生物功能小分子的大環(huán)多胺型熒光探針也是化學(xué)家的重要研究興趣之一。Gunnlaugsson等[51]制備了1個含有4個酰胺懸臂的單核鋱配合物29，其中1個懸臂(天線)含有馬來酰亞胺官能團(tuán)，可以與-SH發(fā)生1，4-Michael加成反應(yīng)。在無GSH時，天線上的能量無法向Tb3+轉(zhuǎn)移，當(dāng)Michael加成反應(yīng)發(fā)生即GSH連接上之后，實(shí)現(xiàn)了能量向Tb3+的轉(zhuǎn)移，熒光大大增強(qiáng)，故此探針可用于對GSH的靈敏檢測。在生命體系中，氧化型谷胱甘肽(GSSG)轉(zhuǎn)化成GSH是一個廣泛存在的還原反應(yīng)，此反應(yīng)需在谷胱甘肽還原酶催化和還原氫(NADPH)做電子給體的條件下發(fā)生。因此，利用29監(jiān)控GSH的產(chǎn)生來間接實(shí)現(xiàn)對谷胱甘肽還原酶的活性監(jiān)測成為可能。通過熒光光譜動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，測定了 4.93、9.86、19.72 nmol·L-1三個谷胱甘肽還原酶濃度下，GSSG平衡轉(zhuǎn)化為GSH的時間差異，分別為36、18和10 min。表明在不同谷胱甘肽還原酶濃度下，體系中GSSG轉(zhuǎn)化為GSH的時間不同，濃度越高，所需時間越短。這樣，可以建立起以29作為GSH探針來測定谷胱甘肽還原酶活性的分析法。

王志林課題組[52]以橋聯(lián)雙三氮環(huán)tacn為金屬離子螯合位點(diǎn)，NBD為熒光團(tuán)制備得到了對Hg2+有響應(yīng)的熒光探針30。進(jìn)而利用Hg與S的強(qiáng)親和力，可實(shí)現(xiàn)對生命體系中常見的含硫物種如GSH與Cys的檢測，成功用于人體血清和胎牛血清中GSH 的檢測，測得含量分別為 810 與 617 μmol·L-1。另外，該探針還具有一定的高爾基體選擇定位能力。該團(tuán)隊(duì)[53]還用BODIPY為熒光團(tuán)合成了BODIPY-tacn-Cu（Ⅱ）配合物31，它對同型半胱氨酸(Hcy)表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性，而GSH、Cys則影響甚微，因而是一個高選擇性的Hcy熒光探針。以內(nèi)標(biāo)法精確測定了健康人體血清中Hcy含量為(36.02±3.02)μmol·L-1，與ELISA 試劑盒檢測的結(jié)果基本一致((34.00±0.77)μmol·L-1)。 胱硫醚 β-合成酶(CBS)是生命體系中一種重要的調(diào)節(jié)Hcy代謝的酶，其活性與一系列和Hcy有關(guān)的疾病關(guān)系密切。在5-磷酸吡哆醛存在下，CBS可催化L-Hcy與等量的L-絲氨酸反應(yīng)生成Cys。因此通過監(jiān)控Hcy的消耗量(或消耗速率)即可實(shí)現(xiàn)CBS活性的檢測。

王明慧等[54]合成了1個基于熒光素-cyclam-Cu(II)的“OFF-ON”型NO探針32。配合物32本身無熒光，當(dāng)與NO反應(yīng)后，在λex=465 nm激發(fā)下產(chǎn)生熒光，最大發(fā)射波長 λem=524 nm。 在 H2O2、ONOO-存在下，32對NO表現(xiàn)出良好的選擇性。隨后作者以NOC-18為NO釋放劑，在 4×10-5～14×10-5mol·L-1濃度范圍內(nèi)，建立了NOC-18濃度與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系曲線，由此即可實(shí)現(xiàn)對NO的直接檢測。

Nagano小組[55]選取熒光素為熒光團(tuán)，以酰胺鍵分別連接tacn、cyclen及cyclam并利用Cu2+為配位金屬離子制備得到了一系列熒光素-大環(huán)多胺-Cu（Ⅱ）配合物33～36。其中34對H2S表現(xiàn)出高選擇性和高靈敏性，ROS與活性氮(RNS)無響應(yīng)，且由于其高穩(wěn)定性，高濃度GSH下也不影響對H2S的檢測。由于激發(fā)波長在可見光區(qū)，可用于細(xì)胞成像，通過以不同濃度的H2S孵育HeLa細(xì)胞，并對照20 min后的細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)I20min/I0min隨Na2S孵育濃度增加而逐漸增大。除此之外，研究證實(shí)34還可廣泛用于檢測各種酶反應(yīng)中產(chǎn)生的H2S，如3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶(3MST)，或來自3MST表達(dá)細(xì)胞的溶菌液及3-巰基丙酮酸等。該探針在胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚 γ-裂解酶(CSE)與 3MST 等的激動劑與拮抗劑的高通量篩選領(lǐng)域頗具潛力，并有望在深入探索H2S的生理功能方面發(fā)揮重要價(jià)值。

楊國強(qiáng)等[56]通過三芳硼烷功能化，連接二苯胺與cyclen，成功制備了3個對Cu2+有響應(yīng)并隨后可用于H2S檢測的熒光探針：37～39。37與38分別含有3個及2個cyclen單元而具有良好的水溶性，39只有1個cyclen而親水性較差。它們與Cu2+形成配合物后，在H2S誘導(dǎo)的有限聚集作用下，其光穩(wěn)定性均有所提高，熒光壽命也發(fā)生了改變。以38孵育NIH/3T3細(xì)胞僅僅5 min后，即可觀測到細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)烈的熒光，而以37和39孵育長達(dá)1 h后，仍然只看到十分微弱的熒光，這表明3個分子中，只有38具有良好的細(xì)胞膜透過性。細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn)表明38能選擇性定位于細(xì)胞的線粒體。因此，在雙光子熒光顯微鏡及熒光壽命顯微鏡輔助下，38-Cu（Ⅱ）被成功用于NIH/3T3成纖維細(xì)胞中對H2S的熒光成像。

圖7 探針29～32的結(jié)構(gòu)Fig.7 Structures of fluorescent probes 29～32

同樣是基于Cu（Ⅱ）-cyclen配合物，黃德建小組[57]以BODIPY為熒光團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了2個高選擇性和靈敏性的“OFF-ON”型H2S熒光探針40與41。它們的發(fā)射波長分別為765與680 nm，對H2S的檢測限均為80 nmol·L-1。40由于具有相對更長的發(fā)射波長(位于近紅外區(qū))，它成功用于對HEK293細(xì)胞中內(nèi)源性H2S的熒光成像。并且通過皮下注射40與Na2S，還實(shí)現(xiàn)了小鼠體內(nèi)H2S的監(jiān)測。41波長較短，則是用于檢測食物中H2S釋放或含量的理想武器。以Na2S或大蒜素 (有機(jī)多硫化物，H2S供體)孵育MCF-7細(xì)胞后，41也成功用于對H2S的熒光成像，且熒光強(qiáng)度與孵育濃度有良好的線性關(guān)系。

圖8 探針33～36的結(jié)構(gòu)Fig.8 Structures of fluorescent probes 33～36

圖9 探針37～42的結(jié)構(gòu)Fig.9 Structures of fluorescent probes 37～42

Wang等[58]以cyclen為銅離子螯合基團(tuán)，蒽環(huán)為熒光團(tuán)，制備了1個H2S熒光探針42。當(dāng)向該探針溶液中加入NaHS后，CuS的生成使得熒光得以恢復(fù)。42對H2S除了優(yōu)良的選擇性，還表現(xiàn)出其它優(yōu)點(diǎn)，如較快的響應(yīng)速度(小于1 min)，良好的可逆性，低的檢測限(205 nmol·L-1)等，最終該探針成功用于HeLa細(xì)胞及斑馬魚中H2S的熒光成像。

Mirra等[59]合成了1個苝環(huán)-cyclam-Cu（Ⅱ）的“籠”形配合物43-Cu（Ⅱ），該配合物也是1個具有較好選擇性的H2S探針，不足是其水溶性較差。

5 生物大分子探針

基于對大環(huán)多胺及其配合物的構(gòu)建，利用金屬中心離子的正電荷與配位作用，制備能特異性識別生物大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)或酶等的小分子熒光探針也是分析化學(xué)家與生物學(xué)家的共同追求。Albelda等[60]以pyclen連接蒽環(huán)制備了化合物44，當(dāng)向其溶液中分別加入單鏈多聚核苷酸如polyA、polyG、polyU和polyC，及雙鏈多聚核苷酸如polyA-polyU、poly(dAT)2和 poly(dGC)2時，紫外可見吸收光譜與熒光光譜均發(fā)生了變化且呈現(xiàn)有規(guī)律的差異。以熒光滴定為例，逐漸加入單鏈嘌呤型的polyA或polyG時，熒光先發(fā)生淬滅，并經(jīng)歷1個最低點(diǎn)后又逐漸恢復(fù)，最終穩(wěn)定在較高的熒光強(qiáng)度(遠(yuǎn)高于未滴定前的自由分子44的熒光強(qiáng)度)，同時最大發(fā)射峰的位置也紅移了8 nm。而富含嘧啶的polyU或polyC則對體系的熒光幾乎沒有影響。上述現(xiàn)象產(chǎn)生的可能原因是44僅能與富含嘌呤的polyA和polyG發(fā)生嵌插結(jié)合。對于雙鏈多聚核苷酸，加入約20倍的polyA-polyU時，熒光強(qiáng)度增加為原來的2倍，且最大發(fā)射波長紅移15 nm。同樣，加入poly(dAT)2后，熒光強(qiáng)度也逐漸增加并紅移，但達(dá)到平衡時poly(dAT)2的量僅為44的3倍。而當(dāng)加入poly(dGC)2時，熒光則逐漸淬滅且無紅移現(xiàn)象發(fā)生。綜上可知，44是一個可用于識別不同單、雙鏈多聚核苷酸的熒光探針。

楊楚羅小組[61]以四苯乙烯-cyclen-Zn（Ⅱ）為載體制備了一個可識別特定DNA的熒光探針45。向該配合物的HEPES緩沖液中加入富含胸腺嘧啶的DNA時，其熒光顯著增強(qiáng)，而富含腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶的DNA對熒光幾乎沒有影響。但由于隨機(jī)DNA的存在，使得其對富含胸腺嘧啶DNA的選擇性不甚理想。為了消除這一弊端，作者創(chuàng)造性地引入苯酚紅與配合物45組裝形成45-苯酚紅而將45的能量轉(zhuǎn)移至苯酚紅，消除了45本身所具有的背景熒光，如愿提高了其對富含胸腺嘧啶DNA的選擇性。45-苯酚紅也成功用于對多聚脫氧胸苷酸序列的檢測，檢測長度可短至2 nt。

圖10 探針43～46的結(jié)構(gòu)Fig.10 Structures of fluorescent probes 43～46

Viehweger等[62]設(shè)計(jì)合成了一個基于tacn的雙模態(tài)表皮生長因子(EGF)探針46。46的結(jié)構(gòu)主要包含4部分：(1)用于螯合64Cu（Ⅱ）的tacn及其支鏈部分；(2)EGF受體識別基團(tuán)D4多肽[63]；(3)熒光團(tuán)近紅外花青染料 sulfo-Cy5；(4) 連接基團(tuán) Cys-β-Ala-β-Ala。Tacn及其支鏈表現(xiàn)出對64Cu2+的快速動力學(xué)結(jié)合，在5 min內(nèi)其放射化學(xué)產(chǎn)率超過95%，同時表現(xiàn)出高度的去金屬化惰性，這無疑表明其可以作為基于64Cu（Ⅱ）的體內(nèi)正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(PET)造影劑。通過激光-熒光光譜法及免疫共沉淀法，研究了D4肽鏈與EGF受體的相互作用。進(jìn)一步地，選取代表性的EGF受體表達(dá)細(xì)胞FaDu與A431，以放射性測量法確定了46與EGF受體的表觀解離常數(shù)Kd約為10 nmol·L-1，充分說明46與EGF受體形成了十分穩(wěn)定的復(fù)合物。因此，對于涉及EGF受體介導(dǎo)的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，46能顯著抑制其中一些關(guān)鍵酪氨酸殘基的關(guān)于EGF誘導(dǎo)的自發(fā)磷酸化活性。綜上所述，雙模態(tài)探針46將有極大潛力成為構(gòu)建EGF受體靶向的納米藥物平臺。

Nagano課題組[64]報(bào)道了1個可以用于比例型測量激酶A(PKA)活性的多肽熒光探針47-Cd（Ⅱ）。該探針由多肽底物通過香豆素生色團(tuán)連接Cd（Ⅱ）-四氮環(huán)而組成，其中Cd（Ⅱ）-四氮環(huán)是磷酸基團(tuán)識別位點(diǎn)。當(dāng)多肽底物上的羥基磷酸化之后，Cd（Ⅱ）-四氮環(huán)即與帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)相互作用，導(dǎo)致激發(fā)波長發(fā)生紅移，由此前的360變?yōu)?10 nm。因此，利用這2個波長下的熒光強(qiáng)度比即可實(shí)現(xiàn)對PKA活性的測定。

Komiyama小組[65]報(bào)道了2個可用來測試?yán)野彼峒っ富钚缘臒晒馓结?8和49。它們是2個雙核Tb3+配合物，可以選擇性地與磷酸化的酪氨酸結(jié)合而發(fā)出強(qiáng)烈的熒光(增強(qiáng)10倍)。這是苯環(huán)上的酚羥基磷酸化后，與雙核Tb3+中心發(fā)生結(jié)合，苯環(huán)吸收的能量可有效傳遞給金屬Tb3+中心所致。遺憾的是激發(fā)波長太短(λex=262 nm)，因而限制了其應(yīng)用于生物體內(nèi)。

另外，前文提及的楊國強(qiáng)等[66]制備的化合物38，除可用于Cu2+和H2S識別外，它還是一個優(yōu)異的比例型RNA熒光探針。當(dāng)向38的水溶液中逐漸加入RNA(來源于圓酵母)時，熒光峰的位置逐漸藍(lán)移，由560 nm藍(lán)移至490 nm，紫外燈下可見其顏色逐漸由黃色變?yōu)樗{(lán)綠色。同樣條件下，加入DNA則藍(lán)移非常微弱。造成明顯差異的原因可能是雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA各堿基對間已經(jīng)形成了各種氫鍵，導(dǎo)致38與DNA間的氫鍵非常微弱。進(jìn)一步的單鏈DNA熒光滴定實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了上述假設(shè)。在38良好的細(xì)胞膜透過性的前提下，用其孵育NIH/3T3細(xì)胞后，通過激光共聚焦熒光成像和雙通道信號輸出，證實(shí)了細(xì)胞核相比于細(xì)胞質(zhì)具有更低的粘度。

6 其他分子離子探針

除了上述作用對象，大環(huán)多胺型熒光探針還在其它領(lǐng)域顯示出頑強(qiáng)的生命力，如納米熒光材料、細(xì)胞微環(huán)境檢測等。劉變化等[67]利用cycle與檸檬酸在微波輻射下制備得到了一種具有明亮藍(lán)光發(fā)射(λem=442 nm)的碳量子點(diǎn)熒光材料。在750 W的微波輻射條件下，整個過程包括縮合、交聯(lián)、碳化只需要5 min，同時其量子產(chǎn)率可達(dá)27.6%。在該碳量子點(diǎn)的表面聚集了密集的cyclen環(huán)，從而能與Eu3+結(jié)合而構(gòu)建得到1個可用于四環(huán)素識別的比例型熒光探針50。在沒有四環(huán)素時，雖然結(jié)合了Eu3+，但此時50只有442 nm熒光發(fā)射峰。當(dāng)加入四環(huán)素后，產(chǎn)生了新的Eu3+特征熒光發(fā)射峰，最強(qiáng)峰位于616 nm處，歸屬于5D0→7F2。隨著四環(huán)素濃度的增加，616 nm處峰強(qiáng)度增加明顯，而442 nm處的峰強(qiáng)度則略微下降。因此，以I616nm/I442nm對四環(huán)素的濃度作圖，即可實(shí)現(xiàn)對四環(huán)素的檢測。 在0～3.5 μg·mL-1的濃度區(qū)間內(nèi)，線性關(guān)系良好(R2=0.998)，計(jì)算可得對四環(huán)素的檢測限為 5.2 ng·mL-1(11.7 nmol·L-1)。選擇性實(shí)驗(yàn)表明，探針50只對四環(huán)素和土霉素有響應(yīng)，而對其它抗生素如慶大霉素、羧芐青霉素、氯霉素、阿莫西林、司氟沙星等無響應(yīng)，原因可能是只有四環(huán)素與土霉素具有相似的β二酮結(jié)構(gòu)。此外，四環(huán)素的加入引起了顏色的逐漸變化，由藍(lán)到紅，作者成功利用手機(jī)及顏色識別app(ColorMeter RGB picker，White Marten)實(shí)現(xiàn)了對四環(huán)素的智能檢測，且線性關(guān)系良好(R2=0.98)。

Kimura等[68]對cyclen雙功能化，引入1個丹磺?；鰺晒鈭F(tuán)，和3個甲胺酰甲基為金屬離子提供配位點(diǎn)，合成得到了對Y3+和La3+具有選擇性的熒光探針51。3個甲胺酰甲基與來源于丹磺?；鶓冶凵螻H去質(zhì)子化的H形成了氫鍵，而導(dǎo)致51在激發(fā)態(tài)下具有強(qiáng)的熒光。加入Y3+或La3+后，甲胺酰甲基側(cè)鏈的配位使得相應(yīng)的配合物十分穩(wěn)定，并允許來自丹磺酰基懸臂去質(zhì)子化的信號傳遞，因而表現(xiàn)出明顯的熒光增強(qiáng)。在pH=7.4的HEPES緩沖溶液中，其它金屬離子如 Zn2+、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Al3+、Au3+、Sc3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+與 Yb3+等均對 51 的熒光無影響。由上可知，51將在Y3+和La3+的定性和定量測定方面具有重要價(jià)值，特別是對于90Y，作為臨床上放療的重要金屬元素之一，對Y3+的傳感必將有用武之地。

李贊等[69]以生物素-組氨酸與BODIPY-cyclen-Cu（Ⅱ）反應(yīng)構(gòu)建了1個可用于監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)乏氧情況的熒光探針52。其作用機(jī)理為：該探針本身由于Cu2+的順磁性淬滅作用而具有很弱的熒光(OFF態(tài))，由于結(jié)構(gòu)中生物素的存在，它能富集于生物素受體過表達(dá)的癌細(xì)胞中，而乏氧癌細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+較高，同時在一些生物還原酶的作用下，Cu2+被還原為 Cu+，并“釋放”了生物素-組氨酸-Cu（Ⅰ），BODIPY-cyclen則游離出來而表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光。在高通量流式細(xì)胞術(shù)條件下，利用52測定了CoCl2處理過的癌細(xì)胞中的乏氧度，為(1.15±0.1)%pO2(RSD 8.7%)，WB定量分析也驗(yàn)證了該結(jié)果。乏氧現(xiàn)象是目前已知的癌細(xì)胞的共性之一，該成果為設(shè)計(jì)新型靶向癌細(xì)胞并可用于研究癌細(xì)胞的乏氧機(jī)制及調(diào)節(jié)的探針提供了借鑒思路。

圖11 探針47～51的結(jié)構(gòu)Fig.11 Structures of fluorescent probes 47～51

圖12 探針52和53的結(jié)構(gòu)Fig.12 Structures of fluorescent probes 52 and 53

唐瑜課題組[70]以Eu3+為中央處理器(CPU)，鑲嵌于cyclen，并以三聯(lián)吡啶基團(tuán)作為手臂(也是識別基團(tuán))制備了1個具有三重識別功能的分子機(jī)器人53：UV-Vis識別 Fe2+； 光致發(fā)光識別 Zn2+；MRI識別Mn2+。理論計(jì)算表明每個過渡金屬離子分別與2個探針分子形成1∶2的復(fù)合物。加入Fe2+，紫外-可見吸收光譜在569 nm處產(chǎn)生新的吸收峰，溶液顏色由無色變?yōu)榉凵?，?jì)算可得對Fe2+的檢測限為0.36 μmol·L-1。光致發(fā)光光譜表明，僅僅在加入Zn2+時，Eu3+的特征熒光峰(617 nm，5D0→7F2)顯著增強(qiáng)，其對Zn2+的檢測限達(dá) 16 nmol·L-1。在 MRI中，沒有 Mn2+時，探針分子 53 的弛豫率為 1.06 mmol-1·L·s-1，加入0.5倍量的Mn2+后，弛豫率增加到5.56 mmol-1·L·s-1，以弛豫率對cMn2+作圖可求得探針53對Mn2+的檢測限為0.1 μmol·L-1。在上述3種識別模式的基礎(chǔ)上，作者還分別構(gòu)建了與之對應(yīng)的3種分子邏輯門：OR、INH及YES。另外，53還可用于實(shí)際生物樣品如人尿液中的Fe2+和Zn2+檢測，具有良好的回收率及精確度。

7 總結(jié)與展望

大環(huán)多胺是一類含有多個N原子而可以被修飾連接各種官能團(tuán)的優(yōu)良陽離子配體，它能直接作為H+及金屬離子的識別基團(tuán)，也可以與金屬離子作用后構(gòu)建得到各種配合物，包括過渡金屬配合物與稀土配合物，并用于陰離子、生物活性小分子、生物大分子等的熒光檢測。因此，大環(huán)多胺在熒光探針的設(shè)計(jì)、合成與應(yīng)用方面得到了廣泛關(guān)注，不斷涌現(xiàn)出優(yōu)秀的成果。盡管如此，但取得突破性進(jìn)展和真正實(shí)現(xiàn)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、生化分析、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的商業(yè)化應(yīng)用還有一定距離。主要原因可能有：(1)大環(huán)多胺的合成困難，路線較長而產(chǎn)率較低，加上后續(xù)的功能化與衍生化，成本高昂。以本課題組常用的pyclen為例，取2，6-吡啶二甲醇和二乙烯三胺為起始原料，需經(jīng)過溴代、苯磺酰化、成環(huán)、脫除苯磺?；戎饕襟E，合成周期長，綜合產(chǎn)率約20%。最常見的cyclen等可以通過商業(yè)途徑購得，但價(jià)格昂貴。(2)探針本身的水溶性、親脂性，探針對目標(biāo)底物的選擇性、靈敏性和作用后的熒光量子產(chǎn)率，以及對細(xì)胞的兼容性、透過性或組織的靶向性和熒光穿透深度等還達(dá)不到實(shí)際分析的要求。(3)現(xiàn)有檢測儀器或手段的局限性。綜合以上分析，要實(shí)現(xiàn)大環(huán)多胺型熒光探針的實(shí)際應(yīng)用，需要有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、生物化學(xué)、材料化學(xué)等學(xué)科的廣泛交叉和融合。實(shí)踐方面，優(yōu)化大環(huán)多胺的合成路線，開發(fā)近紅外甚至遠(yuǎn)紅外區(qū)的熒光團(tuán)，引入水溶性取代基，增加親脂性官能團(tuán)、制成納米材料等值得重點(diǎn)關(guān)注。理論層面，如何提高量子產(chǎn)率、熒光壽命，如何從構(gòu)效關(guān)系上闡述熒光傳感機(jī)理并指導(dǎo)和優(yōu)化熒光探針的設(shè)計(jì)，是未來研究者亟需破解的難題。此外，開發(fā)雙功能或多功能，如診療一體化熒光探針，光學(xué)-光聲等多模態(tài)成像，及光纖導(dǎo)入光動力治療等領(lǐng)域，都將迎來新的機(jī)遇和下一個春天。