董金玲， 賈 琳， 楊 君， 于紅衛(wèi)， 胡中杰， 朱躍科， 孟慶華

首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 肝病重癥醫(yī)學科， 北京 100069

HBV相關慢加急性(亞急性)肝衰竭(hepatitis B virus related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)是我國臨床最為常見的肝衰竭類型。糖皮質激素(glucocorticoid，GC)治療HBV-ACLF在國內外研究中仍存在很大爭議[1]，GC與糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GR)結合后才能發(fā)揮其生物學效應。不同研究表明GC敏感性與GR亞型表達相關，本研究采用前瞻性、非隨機對照入組的研究方法，通過檢測GR及其亞型GR-α、β的表達，探討GC治療HBV-ACLF早、中期患者GR亞型表達特征及其與療效的關系，為GC在臨床中的科學合理應用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 入組2015年9月-2018年6月于本院住院治療的HBV-ACLF患者38例，剔除2例行肝移植者，3例存活超28 d，但未完成28 d觀察研究者，剩余33例納入研究，分為激素組(18例)和非激素組(15例)；激素組根據(jù)患者應用7 d短療程激素后，在第10 d時的臨床癥狀及實驗室指標，分為激素敏感組 (13例) 和激素不敏感組 (5例)。

1.2 納入標準 年齡18～70歲，性別不限；HBV-ACLF早、中期診斷符合《肝衰竭診治指南(2012年版)》[1]診斷標準：(1)極度乏力，有明顯的消化道癥狀；(2)黃疸迅速加深，血清TBil≥171 μmol/L或每日上升≥17.1 μmol/L；(3)出血傾向， 20%

1.3 排除標準 合并其他病毒感染；入組前2個月不可控制的細菌、真菌感染或胃腸道出血者；自身免疫性疾病，酒精性肝病，藥物性肝炎，嚴重的心臟、腎臟、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，腫瘤性疾病，其他禁忌激素類藥物治療的疾病(如活動性潰瘍病、肺結核等)。

1.4 方法

1.4.1 觀察時間點及觀察指標 (1)于入院、8 d、10 d、14 d、28 d觀察：①患者一般狀況、消化道癥狀、腹水、肝性腦病、消化道出血等情況變化；②肝、腎功能、凝血功能等。(2)于入院、8 d檢測GR及GR-α mRNA、GR-β mRNA表達。

1.4.2 治療方案 (1) 內科綜合治療：保肝、抗病毒(恩替卡韋或富馬酸替諾福韋酯)、補充血漿及人血白蛋白、防治感染及并發(fā)癥、人工肝治療(應用激素前后10 d未行血漿置換)等。(2) 激素組在內科綜合治療基礎上給予甲基強的松龍(輝瑞制藥有限公司，Pfizer，NYSE：PFE)1.5 mg·kg-1·d-2，3 d；1 mg·kg-1·d-2，2 d；0.5 mg·kg-1·d-1，2 d，靜脈滴注，總療程7 d。

1.4.3 激素敏感性療效評價標準及分組 (1)激素療效反應敏感者：一般觀察指標明顯改善，PTA>40%或PTA較基線上升>30%，且TBil<10×正常值上限(ULN)或TBil較基線下降>30%[2]。(2)激素療效反應不敏感者：一般觀察指標無改善或較前惡化，TBil和PTA未達激素反應敏感療效者，或評價時間點前發(fā)生死亡者。激素反應療效敏感者歸為激素敏感組，不敏感者歸入激素不敏感組。以上標準制訂參考已發(fā)表的文獻和臨床實際工作經(jīng)驗。

1.4.4 GR及GR-α mRNA、GR-β mRNA測定 使用流式細胞儀(美國，BeckmanFC500)、流式CD3抗體、固定劑、封閉液、破膜劑(美國,Ebioscience公司)、GR單抗及IgG同型對照(美國,Abcam公司)檢測外周血T淋巴細胞GR表達。使用RT-PCR儀(美國,BIORAD)；cDNA合成試劑盒 (TaKaRa公司)、SYBRPremixExTaq及RT-PCR引物檢測外周血GR mRNA亞型表達。引物設計及合成，GR-α、GR-β引物設計參照文獻[3]，GAPDH引物為大連寶生物公司設計合成(表1)。

表1 引物序列

目的基因的表達水平用2-ΔCt表示，ΔCt=待測標本目的基因的Ct值- 待測標本內參基因的Ct值。每一標本的檢測各重復兩孔，取兩復孔檢測的平均值，同時做陰性對照，質控監(jiān)測，保證實驗準確。

1.5 倫理學審查 患者均簽署知情同意書，本研究已通過首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會批準，并備案(批號：京佑科倫字〔2018〕020號)。

2 結果

2.1 2組患者基線資料比較 激素組男17例，女1例，非激素組15例均為男性。2組患者基線時年齡、發(fā)病至入組時間、TBil、PTA、MELD評分、HBV DNA定量、基線皮質醇水平、感染(腹膜炎、肺炎、膽系感染等)及并發(fā)癥(漿膜腔積液、肝性腦病、消化道出血、電解質紊亂、急性腎損傷)發(fā)生情況差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表2)。33例HBV-ACLF患者在28d時共有27例(81.82%)存活，6例(18.18%)死亡，生存曲線顯示，激素組與非激素組28 d生存情況差異無統(tǒng)計學意義(88.89%vs 66.67%，P=0.104)；28d激素組主要死亡原因為感染中毒性休克(1例)和肝、腎功能衰竭(1例)，非激素主要死亡原因為消化道出血(1例)、肝性腦病(1例)、感染中毒性休克(1例)和肝、腎功能衰竭(1例)，激素組與非激素組死因差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。28 d時激素敏感組12例存活(92.3%)，激素不敏感組4例存活(80%)，激素敏感組在第11天時死亡1例，激素不敏感組在第20天時死亡1例。

2.2 2組不同時間點肝功能及凝血指標動態(tài)變化比較 激素組與非激素組各指標不同時間點比較,發(fā)現(xiàn)激素組TBil明顯低于非激素組[8 d:(237.21±142.11) μmol/L vs (385.92±136.66) μmol/L,t=-3.045，P=0.005;10 d:(247.93±173.16) μmol/L vs (393.29±175.76) μmol/L，t=-2.292，P=0.029]。激素組PTA明顯高于非激素組(8 d: 52.10%±19.38 %vs 38.52%±12.64%，t=2.329，P=0.027;10 d: 58.40%±20.23% vs 38.52%±12.64%，t=2.329，P=0.027;14 d: 62.17%±22.98% vs 43.85%±13.09%，t=2.484，P=0.019]。而ALT、AST和Alb在各隨訪點兩組間未見明顯統(tǒng)計學差異(P值均>0.05)。

2.3 2組患者GR及亞型表達比較 2組基線時GR、GR-αmRNA和GR-β mRNA比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。激素組8 d時GR-α mRNA和GR-β mRNA表達水平較基線明顯降低(t值分別為6.586、1.601，P值分別為<0.001、0.128)；且8 d時GR-α mRNA表達水平激素組明顯低于非激素組(P=0.001)(表3)。

2.4 激素敏感組與激素不敏感組不同時間點肝功能及凝血指標動態(tài)變化 在不同時間點，激素敏感組TBil和PTA指標改善明顯優(yōu)于激素不敏感組(P值均<0.05)(表4、5)。

表3 2組GR及其亞型比較

注：與基線GR-α mRNA比較，1)P<0.05；與基線GR-β mRNA比較，2)P<0.05。

表4 激素敏感與不敏感組不同時間點TBil比較

表5 激素敏感組與不敏感組不同時間點PTA比較

2.5 激素敏感組與激素不敏感組基線及8 d時GR及GR-α和GR-β mRNA比較 激素敏感組與激素不敏感組患者基線比較，GR表達水平(88.02%±6.31% vs 89.38%±6.90%)、 GR-α mRNA表達水平[(1.95±0.59)×10-2vs (1.97±0.09)×10-2]、 GR-β mRNA表達水平[(0.20±0.11)×10-2vs (0.11±0.04)×10-2]差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

激素敏感組與激素不敏感組患者8 d比較，2組GR表達水平差異無統(tǒng)計學意義(86.70%±6.20% vs 88.42%±8.46%，t=-0.477，P=0.640)； GR-α mRNA表達水平在激素敏感組明顯高于激素不敏感組[(1.21±0.34)×10-2vs (0.43±0.31)×10-2，t=4.456，P<0.001](圖1)；GR-β mRNA表達水平在激素敏感組[(0.14±0.08)×10-2]與激素不敏感組[(0.10±0.04)×10-2]比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.092，P=0.291)(圖2)。

2.6 激素敏感組與不敏感組患者GR-α mRNA及GR-β mRNA 水平 8 d時較基線下降幅度比較 激素敏感組GR-α mRNA表達降低幅度明顯小于激素不敏感組(t=-2.904，P=0.010)；GR-β mRNA下降幅度在2 組間差異無統(tǒng)計學意義(t=0.665，P=0.516)(圖3、4)。

2.7 激素組不同GR-α mRNA表達水平與TBil和PTA變化的關系 8 d時激素組患者GR-α mRNA表達降低幅度與基線的比值均值為46%，據(jù)此分為≤46%組(10例)和>46%組(8例)。2組GR-α mRNA表達水平降低幅度與基線的比值差異有統(tǒng)計學意義(26.99%±25.09% vs 70.09%±16.08%，t=-4.203，P=0.001)。

10 d時，TBil降低幅度與基線比值在≤46%組和>46%組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021)；10 d時，PTA上升幅度與基線比值在≤46%組和>46%組間差異差異有統(tǒng)計學意義(P=0.048)(圖5)。

3 討論

HBV感染占我國ACLF病因80%以上，HBV-ACLF病死率高達62.18%～72.3%[4]。鑒于供體來源和經(jīng)濟條件的限制，能行肝移植術者有限，內科和人工肝綜合支持治療仍然是治療肝衰竭的主要手段[5]。GC治療HBV-ACLF仍有爭論，但鑒于近年來對GC不良反應及并發(fā)癥防治手段的增強，核苷類似物等病因治療的加強，部分醫(yī)生認為GC可通過抑制細胞毒性T淋巴細胞等淋巴細胞的免疫應答，調節(jié)Th1/Th2、Th17/Treg比例來發(fā)揮免疫抑制作用，延緩或阻止過強的細胞免疫所致的組織損傷[6]，同時能抑制多種促炎細胞因子如TNFα、IFNγ、IL-1和IL-6產(chǎn)生和釋放，增強抑炎因子IL-10的產(chǎn)生與釋放[7-8]，補充不足的皮質醇，延緩或阻止繼發(fā)性的炎癥反應發(fā)生，提高機體應激耐受能力，為肝細胞再生提供有利條件。因此，GC可作為治療肝衰竭的一種治療選擇方法。

臨床治療中發(fā)現(xiàn)機體對GC反應存在個體差異，除目前大多認為GC療效可能與治療人群的選擇及開始用GC治療的時機有關外，考慮與個體GC敏感性相關。GC與GR結合后才能發(fā)揮其生物學效應。GR亞型被認為與GC敏感性密切相關，研究[9]發(fā)現(xiàn)GR數(shù)量及其亞型表達的差異可能影響GC效應。GR主要有GR-α、GR-β兩種形式，GR-α占主導地位，是介導GC發(fā)揮生物學作用的主要受體。多數(shù)研究認為，GC抵抗的發(fā)生可能是由于GR-α表達水平下降所引起，如Liang等[10]報道在原發(fā)免疫性血小板減少癥患者中GR-α表達水平下降與激素抵抗密切相關。而GR-β表達水平極低，不與GC結合，對GC的療效起負性調節(jié)作用，干擾GR-α的功能[10]，并可通過干擾GR-α與轉錄因子NF-κB和AP-1結合阻礙其發(fā)揮作用[11]。但也有部分學者持相反觀點，Jakiea等[12]對40例哮喘患者的研究未發(fā)現(xiàn)GC抵抗與GR-α、GR-β mRNA及GR-β/GR-α有關。目前國內外對于HBV相關肝衰竭GR及其亞型研究較少，Gao等[13]報道HBV-ACLF患者外周血單個核細胞(PBMC)中GR-α mRNA表達水平顯著低于正常人，而GR-β mRNA表達水平顯著高于正常人和慢性乙型肝炎患者。激素受體亞型動態(tài)變化是否對激素療效具有預測作用？本研究發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF短療程甲強龍治療HBV-ACLF患者2周內在改善TBil和PTA指標方面明顯優(yōu)于非激素組。激素敏感組TBil與PTA 10 d、14 d和28 d指標改善明顯優(yōu)于激素不敏感組，激素敏感組GR-α mRNA 8 d降低幅度明顯小于激素不敏感組，提示應用GC后GR-α mRNA表達水平較基線降低。以GR-α mRNA表達降低幅度占基線百分比均值為界線，GR-α mRNA較基線降低幅越小，對激素敏感。應用GC后GR-α mRNA表達降低與Urzua等[14]報道應用GC治療Vogt-小柳-原田病后GR-α mRNA表達上升不一致，但激素敏感者GR-α mRNA的表達高于激素不敏感者的結論是一致的。分析原因可能為：(1)本研究患者均為HBV-ACLF患者，疾病人群不同，免疫功能等基礎不同；(2)推測GR-α mRNA較基線降低，可能是GC進入細胞膜與有效受體結合后在核定位序列的介導下轉入核內發(fā)揮生物學效應，消耗了一定數(shù)量的GR-α，但同時應用激素反應好的患者可能刺激機體產(chǎn)生較多的GR-α；(3)本研究樣本量偏少，應擴大樣本量進一步研究激素受體動態(tài)變化的趨勢及機制。

GR-β可能作為一種潛在的內源性GC效應的拮抗因子，其含量僅占GR-α的0.2%～0.3%，本組資料應用激素后GR-β表達變化趨勢與GR-α一致，對激素療效結果影響較小。本研究發(fā)現(xiàn)HBV-ACLF早、中期患者使用糖皮質激素后GR-α mRNA表達水平明顯降低，激素敏感組患者GR-α mRNA水平較基線降低幅度小，有利于肝功能改善，這對于判斷患者使用激素的療效具有一定指導意義，為遠期是否選擇進行移植術提供一定理論依據(jù)。激素與受體結合發(fā)揮生物學效應遠不止與激素受體亞型表達有關，是一個極其復雜龐大的通路在發(fā)揮作用，任何處于通路中的相關因素都可能影響激素的療效，應深入對此通路進一步研究。