張 楊， 陳淑英， 徐光如

1 上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院 腫瘤科， 上海 200120； 2 復旦大學附屬華山醫(yī)院 檢驗科， 上海 200040

肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是已知最常見的高度惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居前五位[1]。目前肝癌在臨床上以手術(shù)切除為主，化療和放療為輔，具有高復發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率和低長期生存率的特點[2]。大量臨床研究[3-6]發(fā)現(xiàn)，肝癌圍手術(shù)期輸血與肝癌術(shù)后復發(fā)率和生存率密切相關(guān)，但其可能的機制仍不明確。有文獻[7]報道，血液離體后，細胞外泛素含量與儲存時間具有顯著的線性關(guān)系；近期相關(guān)研究[8-9]證實泛素能明顯促進腫瘤進展。而在臨床實踐中，血液采集后用于臨床輸血治療時多已儲存>20 d[10]，因此筆者提出假設，血液中細胞外泛素可能與肝癌術(shù)后的不良預后存在因果關(guān)系。本文旨在通過體外實驗研究細胞外泛素對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響，從而為進一步探索細胞外泛素與肝癌預后的相關(guān)性提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 來源于肝母細胞瘤的肝癌細胞株HepG2(中國科學院上海細胞庫)；胎牛血清(Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Gibco公司)；DMSO(Sigma公司)；CCK8細胞增殖檢測試劑盒(Diojindo公司)；泛素(4841-100，Biovision)；6孔板(Corning 公司)；24孔板(Corning公司)；96孔板(Corning公司)；Transwell小室(Corning公司)；基質(zhì)膠(Corning公司)；結(jié)晶紫(碧云天生物有限公司)；MMP-9抗體(CST生物公司，美國)；β-actin抗體(碧云天生物有限公司)；二抗(山羊抗小鼠，碧云天生物有限公司)。

1.2 不同濃度細胞外泛素的配制 首先，取5支15 ml無菌離心管分別進行編號(1#、2#、3#、4#、5#)。其次，在1#管中加入6.5 ml無菌DMEM，2#～5#管中分別加入6 ml無菌DMEM；取20.8 μl泛素原液(1 μg/μl)加入到1#管中，配制成濃度為3200 ng/ml的泛素儲備液。最后，采用倍比稀釋法，從1#管中取6 ml加入到2#管中，以此類推，最終配制成目標濃度為200、400、800 ng/ml的泛素儲備液，-20 ℃低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞培養(yǎng)和細胞分組 利用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細胞。當HepG2細胞處于最佳狀態(tài)時，在6孔板中接種5×104個細胞/孔，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度達到約80%時，分別用不同濃度的細胞外泛素(200、400、800 ng/ml)進行干預，然后在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育30～60 min。實驗共分為4組：空白對照組，即向HepG2細胞中加入等劑量的DMEM；200、400、800 ng/ml泛素干預組，即利用不同濃度的泛素分別干預HepG2細胞。

1.4 CCK8法檢測細胞增殖 取對數(shù)期細胞，胰酶消化后用完全培養(yǎng)基重懸細胞。96孔板中每孔接種5×103個細胞/100 μl，分別用不同濃度細胞外泛素干預細胞，每組設6個復孔。輕輕混勻后，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，去除培養(yǎng)液，每孔分別加入100 μl含10% CCK8的DMEM溶液，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h后取出。最后使用酶標儀在450 nm處檢測各孔的吸光度值，實驗重復3次。

1.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲 首先，進行實驗前準備，即用無血清培養(yǎng)基對肝癌細胞進行過夜培養(yǎng)，在Transwell板上室鋪設基質(zhì)膠(將無血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按1∶6稀釋后，分別在上室加入100 μl，然后置于37 ℃恒

溫培養(yǎng)箱中孵育4～5 h，使基質(zhì)膠充分凝固)。其次，用無血清的DMEM將肝癌細胞稀釋為5×104個/ml，分別在各實驗組Transwell小室的上室加入100 μl的細胞懸液和不同濃度細胞外泛素，下室加入500 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，用無菌鑷子小心將上室浸沒在下室液體中。最后，將含有Transwell小室的24孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。24 h后，將上室內(nèi)液體去除，放入盛有600 μl PBS的孔內(nèi)，輕輕“十字”交叉清洗3次。結(jié)晶紫染色后，將上室置于電子顯微鏡下觀察，并拍照。

1.6 劃痕實驗和蛋白免疫印跡檢測細胞的遷移能力 用標記筆和直尺在6孔板背后均勻地劃橫線(間隔約0.75 cm)，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線；取對數(shù)生長期的細胞，置于6孔板，細胞密度為5×105/孔，每組設3個復孔。待細胞呈現(xiàn)單層貼壁生長時，用10 μl的消毒槍頭在24孔板垂直劃痕，避免傾斜；用PBS清洗去除劃痕處劃下的懸浮細胞，分別加入不同濃度的細胞外泛素；放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別在0、15、27、34 h置于顯微鏡下拍照，實驗重復3次。根據(jù)文獻[11]報道中的蛋白免疫印跡方法，檢測400 ng/ml泛素對肝癌細胞遷移能力的影響。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖實驗檢測不同濃度細胞外泛素對肝癌細胞增殖的影響 隨著時間的增加，細胞外泛素能明顯促進肝癌細胞的增殖，且具有明顯的濃度依賴性。其中400 ng/ml泛素組對細胞增殖的促進作用最為明顯，在48、72、96 h相對吸光度值均明顯高于對照組(P值均<0.05)(表1)。

2.2 細胞侵襲實驗研究不同濃度細胞外泛素對肝癌細胞侵襲能力的影響 細胞外泛素能明顯促進肝癌細胞的侵襲能力(圖1a)；與對照組細胞的侵襲個數(shù)相比，不同濃度的細胞外泛素均可明顯促進肝癌細胞的侵襲(P值均<0.05)，其中400 ng/ml泛素組對肝癌細胞侵襲能力的促進作用最為顯著[(134.00±8.18)個 vs (347.33±18.90)個，t=17.94,P<0.001](圖1b)。

表1 各實驗組細胞不同培養(yǎng)時間下的相對吸光度值的比較

注：與對照組比較，1)P<0.05。

2.3 細胞遷移和蛋白免疫印跡試驗檢測400 ng/ml泛素對肝癌細胞遷移功能的影響 400 ng/ml泛素明顯增加了肝癌細胞的遷移能力(圖2a)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，腫瘤遷移相關(guān)指標MMP-9的表達在400 ng/ml泛素組明顯增強(圖2b)。

3 討論

肝癌是一種始于肝臟細胞的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、早期發(fā)現(xiàn)難和預后差的特點，臨床發(fā)現(xiàn)確診時病程往往已經(jīng)進展至中晚期階段。隨著醫(yī)學技術(shù)的進步，使得越來越多的患者獲得了手術(shù)干預的機會，圍手術(shù)期備血是手術(shù)前準備的重要環(huán)節(jié)。大量的臨床研究[3]發(fā)現(xiàn)，圍手術(shù)期輸血是肝癌術(shù)后復發(fā)獨立危險因素，但其原因尚不明確。因此深入研究圍手術(shù)期輸血與術(shù)后不良預后的原因，了解引起術(shù)后復發(fā)的分子機制至關(guān)重要。

紅細胞作為一種戰(zhàn)略資源，到目前為止尚無有效的替代品。在臨床實踐中，將血液離體后體外儲存>14 d定義為長期儲存血[12]。輸血是一把雙刃劍，能夠拯救人的生命，但也有諸多副作用[13]。前期的動物實驗[14]發(fā)現(xiàn)，輸注長期儲存血與腫瘤進展有明顯的因果關(guān)系，并建議腫瘤患者圍手術(shù)期輸血選擇新鮮儲存血。紅細胞不僅是泛素的天然載體[15]，且泛素在人類血液制劑離體貯存過程中其含量的增加與血液保存時間存在良好的線性關(guān)系[16]。研究[17]也已證實，CXCR4是泛素在細胞表面的天然受體。體外實驗[18]發(fā)現(xiàn)，泛素可與細胞表面的CXCR4結(jié)合促進心肌血管內(nèi)皮細胞的生成，抗纖維化，抑制心肌細胞凋亡[19]；體內(nèi)動物腫瘤轉(zhuǎn)移模型中，細胞外泛素可通過CXCR4-PI3K-AKT途徑促進多種腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。近期的一項研究[9]報道，長期儲存血中細胞外泛素可能與黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移存在因果關(guān)系。本研究體外細胞增殖實驗結(jié)果證明，細胞外泛素能明顯促進肝癌細胞的體外增殖，且在96 h達到高峰；細胞劃痕實驗和Transwell侵襲進一步表明，細胞外泛素可增加肝癌細胞的侵襲和遷移能力，且細胞外泛素濃度在400 ng/ml時最顯著。

注：a，細胞侵襲實驗(×400)；b，細胞侵襲個數(shù)統(tǒng)計，與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖1不同濃度細胞外泛素對肝癌細胞侵襲能力的影響

此外，細胞外泛素還是人體重要的內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)劑，具有明顯的免疫抑制活性，例如可降低機體炎癥、減少器官損傷、延長器官移植存活時間等[20-22]，因此儲存血中細胞外泛素對肝癌的促進作用，可能通過以下兩個方面發(fā)揮作用：一方面，細胞外泛素的免疫抑制特性打破機體正常的Th1/Th2平衡，使具有促腫瘤作用的Th2細胞因子占優(yōu)勢，導致再發(fā)腫瘤的風險增加；另一方面，輸注衰老紅細胞使微循環(huán)的血流量和功能性毛細血管密度降低50%以上，引起組織缺血缺氧，形成了有利于腫瘤生長的微環(huán)境，細胞外泛素在此過程中進一步參與觸發(fā)免疫和非免疫信號傳導途徑，促進腫瘤的進展[13]。

綜上所述，本研究結(jié)果證實體外細胞外泛素能明顯促進HepG2細胞增殖，增加其遷移和侵襲能力，為進一步研究圍手術(shù)期輸血與肝癌不良預后的分子機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。