劉威良，吳白芬，黃艾祥

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201; 2.云南經(jīng)濟管理學(xué)院，昆明 650106)

辣木(Moringaoleifera)，為辣木科辣木屬的熱帶落葉木本蔬菜及油料作物，別名為鼓槌樹、洋椿樹等，原產(chǎn)于印度北部喜馬拉雅山南麓的速生樹種[1]。辣木渾身是寶，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、膳食纖維等，并具有克服失眠、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功效，可作為優(yōu)質(zhì)的保健食品原料[2]。我國于20世紀60年代初將辣木引種云南，最初只注重其栽培育種，且種植規(guī)模較小，隨后意識到其重要的營養(yǎng)及藥用價值，目前我國臺灣、廣東、廣西和福建等地也有廣泛種植并建有種植基地。2012年我國衛(wèi)生部批準辣木葉為新資源食品，2014年中國-古巴辣木科技合作中心在云南省熱帶作物科學(xué)研究所成立，標志著辣木在我國的關(guān)注度日益增強。目前，辣木已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、飼料及凈水等領(lǐng)域，具有較大的商業(yè)和工業(yè)開發(fā)潛力。

辣木籽為辣木的種子，呈球形，直徑約1 cm，質(zhì)量約為0.3 g，富含油脂、蛋白質(zhì)及微量礦物元素等營養(yǎng)成分，亦具有多種藥物活性如降血脂、降血糖、抗紫外線損傷等[3]。Abdulkarim等[4]研究指出，辣木籽含油率為31%，王有瓊等[5]亦報道辣木種子去皮后種仁含油率高達39%。辣木籽油室溫下呈淡黃色，具有無味、抗氧化性強、不易腐敗等優(yōu)良特性，其中脂肪酸的種類和組成與橄欖油類似，同時還含有生育酚、甾醇及維生素E等微量營養(yǎng)成分，被認為是食用橄欖油的理想代替品[6]。除作食用油外，辣木籽油還被廣泛應(yīng)用于化妝品、潤滑油和生物柴油的制備。目前對辣木籽油的研究還停留在提取純化初級階段，對其活性的研究深度不夠，同時其對免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用未見報道。本實驗主要以辣木籽油為研究材料，結(jié)合藥理學(xué)動物實驗?zāi)Ｐ?，初步考察其對小鼠免疫活性的影響，進而為其后期用于改善免疫功能的保健品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

新鮮辣木籽，購于云南天佑科技開發(fā)有限公司，置于室外通風(fēng)處自然晾干。

醋酸潑尼松(批號：20180518)，浙江仙琚制藥股份有限公司；印度墨水(批號：20180512)，Solarbio生化試劑公司；羧甲基纖維素鈉；吐溫-80、無水乙醇、石油醚等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗動物

SPF級昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g，采購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證為SCXK(湘)2016-0002。

1.1.3 飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級動物實驗室，云南省昆明市中國科學(xué)院昆明植物所動物實驗中心，許可證號為SYXK(滇)K2013-0004。

1.1.4 儀器與設(shè)備

Thermo1500全波長酶標儀(芬蘭雷勃公司)，RE520旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Scientz-500C多功能恒溫超聲萃取儀，400Y多功能粉碎機，ZYJ-9018-2小型榨油機，CP153電子天平，TDL-5-A離心機，LC-162C海爾冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木籽油的制備

1.2.1.1 冷榨法

參考文獻[7]方法并改進。取干燥辣木籽1 000 g，除雜去殼，設(shè)置榨油機參數(shù)為溫度6℃、壓力4 MPa、轉(zhuǎn)速36 r/min榨油，毛油靜置去除沉淀，得壓榨辣木籽油，稱重并分裝于無菌離心管中，凍存于-20℃冰箱備用。

1.2.1.2 超聲輔助溶劑萃取法

參考文獻[8]方法并改進。取干燥辣木籽1 000 g，除雜去殼，粉碎，過80目篩，低溫避光保存。取一定量的辣木籽粉置于500 mL平底燒瓶中，采用超聲輔助溶劑萃取法，以沸程60～90℃的石油醚為溶劑，在料液比1∶10、萃取溫度75℃、萃取時間35 min、超聲頻率60 Hz下反復(fù)萃取4次，合并萃取液，旋蒸，得到萃取辣木籽油。

1.2.2 動物分組及劑量

按人用藥量折算為小鼠灌胃劑量。小鼠購買回來后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，將130只小鼠按體重隨機分為10組，確保組間體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)，每組13只，即空白組(20 mL/kg)、模型組(醋酸潑尼松)(10 mg/kg)、壓榨辣木籽油高劑量組(2 g/kg)、壓榨辣木籽油低劑量組(1 g/kg)、萃取辣木籽油高劑量組(2 g/kg)、萃取辣木籽油低劑量組(1 g/kg)、壓榨辣木籽油(2 g/kg)+醋酸潑尼松(10 mg/kg)組、壓榨辣木籽油(1 g/kg)+醋酸潑尼松(10 mg/kg)組、萃取辣木籽油(2 g/kg)+醋酸潑尼松(10 mg/kg)組、萃取辣木籽油(1 g/kg)+醋酸潑尼松(10 mg/kg)組。各組均灌胃給藥，空白組給予同等劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；聯(lián)合用藥組2種藥物給藥時間間隔至少為4 h。小鼠連續(xù)灌胃14 d期間不定期測定各組小鼠體重，并觀察各組小鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、飲食與糞便有無異常。14 d后測定小鼠的碳粒廓清指數(shù)、臟器指數(shù)及吞噬指數(shù)。

1.2.3 小鼠免疫抑制模型的建立

參考文獻[9]方法并改進。采用醋酸潑尼松(10 mg/kg)連續(xù)灌胃給藥，致使小鼠免疫器官(胸腺和脾臟)萎縮，建立小鼠免疫抑制模型。連續(xù)給藥數(shù)天后，與空白組相比，模型組小鼠體重有減小的作用趨勢且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，小鼠免疫器官指數(shù)有明顯降低趨勢且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，表明造模成功。

1.2.4 小鼠碳粒廓清實驗

小鼠連續(xù)給藥14 d后，實驗前6 h，禁食不禁水，于末次給藥后30 min，立即尾靜脈注射20%的印度墨汁(0.1 mL/10 g)，分別于2、12 min眼眶取血20 μL，立即溶于2 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的Na2CO3溶液中搖勻，置于波長為680 nm處比色，測定其OD值，計算廓清指數(shù)(K)。K=(lgOD2-lgOD12)/(T12-T2)。

式中：OD2、OD12分別為2、12 min取血樣的OD值；T12-T2為所取血樣間隔的時間差[10]。

1.2.5 小鼠臟器指數(shù)及吞噬指數(shù)的測定

小鼠取血完成后，脫頸椎處死。取肝、脾臟及胸腺，用濾紙吸干其表面血漬，并精確稱重，計算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與吞噬指數(shù)(α)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體重，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體重，α=K1/3×體重/(肝重+脾重)[11]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 壓榨和萃取辣木籽油對小鼠體重的影響(見表1)

表1 壓榨和萃取辣木籽油對小鼠體重的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

給藥期間，各組小鼠毛色有光澤，活潑好動，狀態(tài)較好，未出現(xiàn)不良反應(yīng)。由表1可看出：給藥期間，各組小鼠體重整體均呈增長趨勢，組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；但與空白組比較，給藥14 d后，模型組、壓榨與萃取辣木籽油聯(lián)合用藥各劑量組，小鼠體重顯著降低且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。

2.2 壓榨和萃取辣木籽油對小鼠免疫器官質(zhì)量的影響(見表2)

由表2可看出：連續(xù)灌胃給藥14 d后，與空白組比較，壓榨與萃取辣木籽油高劑量組均顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，低劑量組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；模型組、壓榨與萃取辣木籽油聯(lián)合用藥各劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯降低且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。與模型組比較，經(jīng)高劑量辣木籽油干預(yù)后免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)均顯著升高，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；壓榨與萃取辣木籽油各劑量組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)明顯高于模型組且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，兩種提取工藝辣木籽油同劑量組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異且具有等效性，不同劑量組之間呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

表2 壓榨和萃取辣木籽油對小鼠免疫器官質(zhì)量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。下同。

2.3 壓榨和萃取辣木籽油對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響(見表3)

由表3可看出：連續(xù)灌胃給藥14 d后，與空白組比較，壓榨與萃取辣木籽油高劑量組均提高小鼠巨噬細胞的吞噬指數(shù)，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，免疫抑制小鼠經(jīng)壓榨與萃取辣木籽油干預(yù)后小鼠巨噬細胞的吞噬指數(shù)提高，且高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。兩種提取工藝辣木籽油同劑量組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異，具有等效性，不同劑量組之間呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

表3 壓榨和萃取辣木籽油對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

2.4 壓榨和萃取辣木籽油對小鼠巨噬細胞廓清功能的影響(見表4)

由表4可看出:連續(xù)灌胃給藥14 d后，與空白組相比，壓榨與萃取辣木籽油高劑量組小鼠巨噬細胞的廓清指數(shù)均升高，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；與模型組比較，免疫抑制小鼠經(jīng)高劑量壓榨與萃取辣木籽油干預(yù)后其巨噬細胞的廓清指數(shù)明顯提高，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。其他各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，兩種提取工藝辣木籽油同劑量組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異且具有等效性，不同劑量組之間呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

表4 壓榨和萃取辣木籽油對小鼠巨噬細胞廓清功能的影響

2.5 討論

人體的免疫功能是由免疫分子、免疫器官和免疫細胞等組成的系統(tǒng)共同參與并執(zhí)行，是機體的一種保護性生理反應(yīng)，能夠辨識自身并對抗外來物質(zhì)[12]。免疫有特異性與非特異性之分，前者是指在有外來抗原物質(zhì)如細菌、病毒等入侵機體時，與病原體發(fā)生的特異性反應(yīng)，是一種獲得性免疫；而后者為一種與生具有的天然性免疫，是人體防御系統(tǒng)的第二道防線[13]。研究表明，評價機體免疫效應(yīng)的“黃金標準”之一是計算免疫器官(胸腺與脾臟)的臟器指數(shù)[14]。研究還表明，單核巨噬細胞的吞噬能力可以衡量機體非特異性免疫功能，具體表現(xiàn)在吞噬指數(shù)、廓清指數(shù)的水平高低[15]。根據(jù)表1可知，用藥14 d后，與空白組比較，模型組、壓榨與萃取辣木籽油聯(lián)合用藥各劑量組小鼠體重顯著降低(P<0.01)，這是因為醋酸潑尼松使機體免疫降低的同時降低體重，這也證明本實驗免疫抑制模型造模成功。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，辣木籽油除作為食用油外還具有抗氧化、降血糖及抗腫瘤等生理功效[16-17]，其給藥途徑多為靜脈注射或腹腔注射，經(jīng)口給藥的研究較少。腫瘤會影響機體的免疫功能，導(dǎo)致細胞免疫和體液免疫受到抑制，體外細胞實驗中辣木籽油表現(xiàn)出很好的抗癌效果;而在體內(nèi)健康及免疫抑制狀態(tài)下的小鼠中，辣木籽油對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用未見報道。本文采用灌胃給藥途徑，并對兩種提取工藝的辣木籽油進行對比研究。研究結(jié)果得出，經(jīng)口灌胃2周辣木籽油后并未影響小鼠體重，但對免疫器官質(zhì)量及巨噬細胞的吞噬能力有一定干預(yù)作用，證明兩種提取工藝的辣木籽油高劑量組(2 g/kg)均能明顯改善正常小鼠和免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能，同時也發(fā)現(xiàn)兩種提取工藝辣木籽油具有等效性且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。但本文所采用的實驗對象為正常小白鼠，而非裸鼠(沒有胸腺的模式動物)，考慮實驗操作簡便、成本及實驗的側(cè)重點，免疫抑制動物模型的建立是選用糖皮質(zhì)類激素藥物醋酸潑尼松而非環(huán)磷酰胺，后者更側(cè)重細胞免疫的抑制作用?；谝陨戏翘禺愋悦庖哐芯康慕Y(jié)果，后期研究可能考察對細胞免疫的影響進而綜合探究辣木籽油對免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用，且其作用機制尚待進一步研究。

3 結(jié) 論

本文以兩種提取工藝(壓榨和超聲輔助溶劑萃取)制得的辣木籽油經(jīng)口連續(xù)灌胃小鼠14 d，通過測定小鼠體重、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)、碳粒廓清實驗和巨噬細胞吞噬實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取工藝制得的辣木籽油高劑量組(2 g/kg)均能顯著提高小鼠免疫器官指數(shù)，增強巨噬細胞的吞噬清除能力。說明辣木籽油具有增強小鼠免疫的能力。