黃 彪,劉文靜,方 靈,韋 航,吳建鴻,傅建煒,*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,福建福州 350003; 2.福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室,福建福州 350003)

我國茶葉品種資源多,種植范圍廣,制作工藝歷史悠久。一般根據(jù)外形、色澤及制作方法的不同將茶葉分為綠茶、紅茶、黃茶、青茶(烏龍茶)、黑茶和白茶六大茶類[1]。不同茶葉生理功效和活性成分的研究一直是近些年來的熱點。研究表明茶葉品質(zhì)及其活性成分不僅與茶樹品種相關(guān)[2-4],還與生長環(huán)境[5-6]、采摘時期[3]、加工工藝[7-9]等諸多因素相關(guān)。福建省茶樹品種資源豐富,茶葉生產(chǎn)工藝獨特,茶葉品質(zhì)優(yōu)良,較為出名的有烏龍茶 “鐵觀音”、“武夷肉桂”、“大紅袍”、“武夷水仙”,白茶“福鼎白茶”、“政和白茶”等等。福建出產(chǎn)的茶葉香氣醇厚,富含多種活性成分,尤其是烏龍茶與白茶等具有良好保健功效,經(jīng)中醫(yī)藥理證明有消暑解毒,消炎治病的功效[10-11]。

茶葉因含茶多酚、咖啡堿、氨基酸、茶多糖、維生素等營養(yǎng)功能成分[12-13],其良好的抗衰老、抗癌變、殺菌和降低血糖等功效一直以來受到研究者的重視[14-16]。茶葉中的茶多酚主要包括兒茶素類、黃酮類、酚酸類、花色素類等物質(zhì),其含量占茶葉干重的20%左右;而具有抗氧化作用的兒茶素類物質(zhì)占茶多酚總量的70%左右,主要包括兒茶素((+)-catechin,C)、表兒茶素((-)-epicatechin,EC)、沒食子兒茶素((-)-gallocatechin,GC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、兒茶素沒食子酸酯((-)-catechin gallate,CG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG),沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-gallocatechin gallate,GCG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)等物質(zhì)。目前對兒茶素類物質(zhì)的測定方法研究多采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[17-19]。從靈敏度、準(zhǔn)確性上看,HPLC法是目前較為有效的方法,但是HPLC方法往往存在前處理步驟繁瑣、檢測用時長等問題;而茶葉中的多酚物質(zhì)多為易氧化的活性物質(zhì),檢測時間長有可能造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。而UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)能將HPLC對復(fù)雜樣品的高分離能力與MS的高選擇性和高靈敏度有效結(jié)合起來,檢測過程迅速,在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和食品檢測的領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛,但是運用LC-MS/MS技術(shù)對茶葉中活性物質(zhì)多組分的分析仍不多見[20-22],而目前有關(guān)LC-MS/MS方法分析福建茶葉中活性物質(zhì)含量的報道則更為少見。

本研究以福建烏龍產(chǎn)和白茶為研究對象,建立了同時快速分析茶葉中8種兒茶素物質(zhì)的UPLC-MS-MS方法,分析比較了幾種福建烏龍茶和白茶中兒茶素類活性物質(zhì)含量,以期為福建茶葉資源的利用和產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏龍茶鐵觀音(2018) 福建泉州市安溪縣;肉桂(2018)福建武夷山市。白茶:白牡丹(2018)福建福鼎市;壽眉(2018)福建福鼎市;兒茶素(C)、表兒茶素表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)等 純度>97%,南京道斯夫生物技術(shù)股份限公司;甲醇、乙腈、甲醇 色譜純,Fisher公司;乙酸銨、甲酸 LC-MS級,Waters公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S三重四級桿質(zhì)譜 美國Waters公司;XW-80A旋渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠;Millipore Direct-Q5超純水儀 美國Millipore Qirect-Q5;SYG-2水浴恒溫振蕩器 常州朗越儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 UPLC-MS/MS方法樣品前處理及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 樣品前處理:稱取0.2 g磨碎過篩后的茶樣于10 mL棕色玻璃管中,加入在70 ℃預(yù)熱過的70%甲醇溶液5 mL,混勻后置于70 ℃水浴中振蕩提取10 min(每隔5 min攪拌一次),提取后冷卻至室溫,在3500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶。殘渣再用5 mL 70%甲醇溶液提取一次,重復(fù)以上操作。合并提取液定容至10 mL,搖勻,0.45 μm濾膜過濾,濾液稀釋1000倍,待上機(jī)分析用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:精確稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg,分別用甲醇溶解后定容到10 mL,即得濃度為1000 μg/mL的不同標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)單標(biāo)母液,備用。用于制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的不同濃度的混標(biāo)溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 HPLC方法樣品前處理及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 參照GB/T 8313-2018茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法。

1.2.3 UPLC-MS/MS方法色譜條件 色譜柱:Waters T3 C18柱(Φ1.8 μm,2.1 mm×50 mm);柱溫:30.0 ℃;流速:0.2 mL/min;流動相A為0.1%(V/V)甲酸水溶液,流動相B為甲醇;洗脫梯度:0～3 min,90%～70% A;3～5 min,70%～30%A;5～8 min,30%～90% A;進(jìn)樣量:4 μL。

1.2.4 UPLC-MS/MS方法的質(zhì)譜條件 參考文獻(xiàn)質(zhì)譜方法檢測兒茶素的條件[23]。掃描方式:電噴霧離子源(ESI),正離子掃描模式;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;毛細(xì)管電壓:2.5 kV;脫溶劑氣:N2,流速800 L/h,脫溶劑溫度:500 ℃;錐孔氣流:N2,流速50 L/h;離子源溫度:150 ℃;霧化氣壓力:0.28 MPa;碰撞氣:氬氣。以100 μg/L的兒茶素類物質(zhì)的單標(biāo)溶液進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化,確定特征母離子和子離子,優(yōu)化后相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 8中兒茶素類物質(zhì)檢測的質(zhì)譜參數(shù)條件Table 1 LC-MS/MS parameters for 8 catechin compounds

1.2.5 HPLC方法的色譜條件液相色譜條件 參照國標(biāo)方法GB/T 8313-2018茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法色譜條件[24],實驗在Waters e-2695高效液相色譜儀上完成。色譜柱:Waters CORTECS C18柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm);柱溫:35.0 ℃;檢測器:二極管陣列檢測器;檢測波長:278 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;流動相A和流動相B為按GB/T 8313-2018方法配制成的乙腈-水溶液。洗脫梯度:0～10 min,保持100% A;10～15 min,100%～68% A;15～25 min,保持68% A;25～30 min,68%～100% A。進(jìn)樣量:10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

UPLC-MS/MS方法數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析在Waters三重四級桿液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀MassLynx軟件上進(jìn)行處理,實驗重復(fù)3次,外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

國標(biāo)方法[24]利用液相色譜法檢測茶葉中兒茶素類物質(zhì),在將茶葉樣品用70%甲醇溶液提取,得到提取液母液后,檢測分析前加入穩(wěn)定溶液(由10 mg/mL EDTA溶液25 mL,10 mg/mL抗壞血酸溶液25 mL,乙腈50 mL加入到500 mL容量瓶中定容后得到)。由于茶葉中多酚物質(zhì)往往容易氧化,而茶葉中的多酚物質(zhì)主要為兒茶素類物質(zhì),較容易氧化且由于種類較多,利用HPLC分離、檢測往往耗時較長,為保持茶葉中兒茶素類物質(zhì)的穩(wěn)定性,保證結(jié)果的準(zhǔn)確,往往需要加入穩(wěn)定液。而UPLC和UPLC-MS/MS由于分離速度快,檢測迅速,相關(guān)文獻(xiàn)報道在利用70%甲醇溶液提取樣品后進(jìn)行UPLC和UPLC-MS/MS分析,一般不加入穩(wěn)定溶液而直接進(jìn)行上機(jī)檢測[17]。另外利用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測分析,提取液通過色譜柱分離,經(jīng)霧化器霧化后,經(jīng)質(zhì)譜檢測器檢測,應(yīng)避免用無機(jī)酸及鹽進(jìn)入質(zhì)譜儀以免對儀器造成損害。因此,實驗建立UPLC-MS/MS方法檢測茶葉中兒茶素類物質(zhì),在前處理過程中得到提取液母液,參考文獻(xiàn)[17]提取方法,在母液中不添加穩(wěn)定液。由于UPLC-MS/MS靈敏度較高,在得到母液后,稀釋1000倍,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后直接上機(jī)測試。

2.2 方法評價

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢出限 將兒茶素類化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照1.2中小節(jié)中的條件進(jìn)樣,目標(biāo)化合物的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖如圖1所示。在優(yōu)化條件下,考察了8種目標(biāo)化合物的線性范圍,相關(guān)系數(shù)及檢出限。在各化合物相應(yīng)的濃度范圍內(nèi),目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x,μg/L)與對應(yīng)的峰面積(y)呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)為0.9966～0.9994。依據(jù)特征離子色譜峰色譜信號的3倍信噪比(S/N(3)確定方法的檢出限,方法的檢出下限為0.2～1.1 μg/L(表2)。

表2 8種目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Linear range,linear equation,correlation coefficient and detection limit of 8 target compounds

圖1 8種兒茶素類化合物多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring(MRM)chromatograms of 8 catechins

2.2.2 加標(biāo)回收率 根據(jù)各目標(biāo)物的響應(yīng)信號情況及在茶葉中的含量情況進(jìn)行了相應(yīng)的加標(biāo)實驗(n=6),加標(biāo)回收率為85.9%～109.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.9%～6.7%之間(表3),方法符合的檢測要求。

表3 茶葉中8種兒茶素類物質(zhì)測定的加標(biāo)回收實驗(n=6)Table 3 Recovery rates of 8 catechins compounds

2.2.3 精密度實驗 選取2、5、10、50、100 μg/L 5個濃度的各化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液驗證精密度,按照優(yōu)化的實驗條件進(jìn)行測測試,每個濃度進(jìn)行6次平行測試,結(jié)果表明:8種兒茶素類化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液含量的RSD均在0.032%～0.99%之間,說明該試驗方法具有良好的精密度,符合分析測定的要求。

2.2.4 重復(fù)性實驗 選取同一樣品6份,按照建立的方法進(jìn)行前處理得到樣品提取液,同一批進(jìn)樣。結(jié)果表明樣品檢測出的7種兒茶素類物質(zhì)含量的RSD均在0.28%～1.01%之間,表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性實驗 將所得的樣品提取溶液,測定24 h內(nèi)各兒茶素組分的含量變化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品溶液各化合的含量,計算各組分含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值來考察各組分在樣品溶液的穩(wěn)定性,結(jié)果表明兒茶素類物質(zhì)的含量隨時間呈下一定的下降趨勢,但其含量的RSD值在0.061%～1.49%之間,雖然有下降但是下降幅度較小,樣品溶液具有一定的穩(wěn)定性,主要是因為兒茶素類物質(zhì)長時間存放可能氧化的原因,說明在對樣品進(jìn)行提取后,檢測迅速有利于結(jié)果的準(zhǔn)確。

2.3 HPLC與UPLC-MS/MS檢測茶葉中兒茶素類物質(zhì)含量的比較

相對于HPLC,UPLC-MS/MS檢測更為迅速、靈敏、準(zhǔn)確。HPLC多通過對目標(biāo)化合物的紫外吸收形成的色譜峰的識別而實現(xiàn)對物質(zhì)的定性、定量,有時易產(chǎn)生假陽性;UPLC-MS/MS通過對目標(biāo)化合物母離子、碎片子離子的識別實現(xiàn)對物質(zhì)的定性、定量,但是在質(zhì)譜檢測中有時由于抑制效應(yīng)影響碎片子離子的形成而對檢測結(jié)果造成一定的影響。在實驗中,選取樣品分別利用UPLC-MS/MS與HPLC法對茶葉中兒茶素類物質(zhì)含量的分析進(jìn)行了比較,如表4所示,兩種方法檢測兒茶素類物質(zhì)含量較為接近,兒茶素類物質(zhì)的含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均<10%,說明建立的方法準(zhǔn)確度高。

表4 HPLC與UPLC-MS/MS檢測茶葉中兒茶素類物質(zhì)含量比較(mg/g)Table 4 Comparison of detection results of HPLC and UPLC-MS/MS methods(mg/g)

2.4 茶葉樣品的檢測

選取采集的烏龍茶樣品3份(其中鐵觀音2份,肉桂1份),白茶樣品5份(其中白牡丹2份,壽眉3份)按照建立的方法,對茶葉中的兒茶素類化合物含量進(jìn)行檢測分析。每個樣品重復(fù)測定3次,不同茶類樣品中兒茶素類物質(zhì)含量的檢測結(jié)果見表5所示。

表5 不同工藝的茶類其活性成分含量(mg/g)Table 5 Contents of ten bioactive compounds in different tea samples(mg/g)

從實驗結(jié)果來看,相對于其它兒茶素類物質(zhì),表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在茶葉中的含量最高,約占茶葉中兒茶素總量的60%。分析所收集的幾種福建茶葉樣品,烏龍茶中兒茶素總量的含量范圍為43.59～45.21 mg/g,白茶兒茶素總量的含量范圍為50.52～70.71 mg/g。白茶中EGCG及兒茶素總量較烏龍茶中高,這主要因為白茶加工工藝相對簡單,其生產(chǎn)加工主要是茶鮮葉經(jīng)過長時間的萎凋,然后烘干。在長時間的萎凋過程中,兒茶素類物質(zhì)在多酚氧化酶、過氧化物酶等作用下發(fā)生緩慢而輕度的氧化反應(yīng),茶葉中兒茶素的主要成分EGCG含量有一定程度的減少,兒茶素總量也會有所降低。而烏龍茶作為一種半發(fā)酵茶,其制作工藝相對復(fù)雜,曬青、涼青、做青等工序歷時較長,發(fā)生以多酚類酶促氧化作用和水解作用為主導(dǎo)的一系列生化反應(yīng),EGCG含量下降較多,兒茶素總量的變化也較大。

3 結(jié)論

建立UPLC-MS/MS方法對茶葉中的兒茶素類物質(zhì)進(jìn)行檢測,方法簡便、快速,有效縮短分析時間。運用該方法對福建省幾種茶葉中的兒茶素類物質(zhì)進(jìn)行了分析,所收集的樣品中EGCG在茶葉中的含量均為最高。由于品種與加工工藝的不同,相對來說,白茶樣品中EGCG的含量與兒茶素的總量較烏龍茶高。本研究建立的方法可為茶葉中多種活性物質(zhì)的分析提供參考,本研究的實驗結(jié)果可為茶葉品質(zhì)與營養(yǎng)功能的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù),對于不同茶葉資源的開發(fā)研究具有一定的參考意義。