蔣 湘,吳 毅,黃燕紅,劉珈伶,趙就彬

(廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心,廣西南寧 530001)

隨著人們生活水平的提高,雞蛋已成為餐桌上不可或缺的食物。在禽類養(yǎng)殖過程中,獸藥起到防治疫病的重要作用,由此造成獸藥及其代謝物在禽蛋中殘留超標(biāo)的現(xiàn)象屢有發(fā)生。氯霉素類藥物(Chloramphenicols)能夠抑制易感細(xì)菌中的蛋白質(zhì)合成,廣泛用于禽畜生產(chǎn),但該類藥物在易感人群中易引起再生障礙性貧血[1],因此,在家禽產(chǎn)蛋期間禁止使用,我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)[2]規(guī)定動(dòng)物源食品不得檢出氯霉素類藥物。氟蟲腈類藥物(Fluorine nitrile)為廣譜殺蟲劑,其代謝產(chǎn)物有氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚和氟甲腈,代謝物毒性均強(qiáng)于原藥,我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2009年發(fā)布公告停止生產(chǎn)銷售氟蟲腈農(nóng)藥[3]?？共《绢愃幬?Antiviral)是一類用于治療甲型流感病毒感染的抗病毒劑,常被非法用于養(yǎng)雞業(yè)[4],其對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)造成危害[5],我國(guó)農(nóng)業(yè)部560號(hào)公告規(guī)定養(yǎng)殖業(yè)禁止使用金剛烷胺、金剛乙胺類抗病毒藥物[6]?；前奉愃幬?Sulfonamides)是一組用于治療和預(yù)防人類和動(dòng)物感染的抗菌藥物,因其廣譜活性和低成本而被廣泛使用,但其在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢,對(duì)人體易造成蓄積危害,特別是機(jī)體對(duì)抗生素的耐藥性[7-8]。我國(guó)對(duì)禽蛋中磺胺類獸藥尚未制定殘留限量值。硝基咪唑類藥物(Nitroimidazoles)是治療和控制大腸桿菌或沙門氏菌所引發(fā)疾病的抗生素,用于禽畜養(yǎng)殖中疾病治療與控制,因其具有潛在的致癌性和致突變性[9],我國(guó)明確該類藥物不得在動(dòng)物源食品中檢出[2]。

藥物殘留分析方法主要有氣相色譜法[10]、高效液相色譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14],高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法因具有高靈敏度、高選擇性而被廣泛用于藥物多殘留的分析。藥物殘留分析前處理技術(shù)主要有固相萃取[15]、多壁碳納米管[16-18]、QuEChERS技術(shù)[19-20]等。多壁碳納米管(Multi-walled carbon nano-tube,MWCNT)為新型吸附材料,由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和巨大的表面積,可以作為有效的吸附劑來吸附復(fù)雜基質(zhì)中的干擾物質(zhì)[21]。QuEChERS(快速、簡(jiǎn)便、便宜、有效、堅(jiān)固和安全)方法在首次引入后經(jīng)過分析工作者的不斷改良,已廣泛用于各種食品基質(zhì)中的農(nóng)藥和獸藥多殘留分析。

目前我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于獸藥殘留前處理方法主要為固相萃取、液-液萃取、QuEChERS技術(shù),并且大部分應(yīng)用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)各種類型的藥物殘留進(jìn)行分類檢測(cè),檢測(cè)成本高,效率低。本研究以乙腈沉淀蛋白,改良QuEChERS技術(shù),以多壁碳納米管、十八烷基鍵合硅膠、乙二胺-N-丙基硅烷(MWCNTs-C18-PSA)3種吸附劑組合凈化樣品,建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定氯霉素、氟蟲腈、抗病毒、磺胺、硝基咪唑5大類共44種藥物殘留量的高通量方法,并對(duì)82批雞蛋中藥物殘留進(jìn)行快速篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、甲酸、甲酸銨 色譜純,德國(guó)Merck公司;實(shí)驗(yàn)用水 超純水(18.2 MΩ);鹽包 無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末(4∶1,質(zhì)量比),Waters公司;多壁碳納米管 MWCNTs,純度95%,長(zhǎng)度10～30 μm,直徑10～20 nm,XFNANO公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18粉 CNW公司;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):氯霉素(Chloramphenicol)、氟苯尼考(Florfenicol)、甲砜霉素(Thiamphenicol)、氟蟲腈(Fipronil)、氟甲腈(Fipronil-desulfinyl)、氟蟲腈砜(Fipronil-sulfone)、氟蟲腈亞砜(Fipronil-sulfide)、金剛烷胺(Amantadine)、金剛乙胺(Rimantadine)、美金剛(Memantine)、咪喹莫特(Imiquimod)、嗎啉胍(Moroxydine)、奧司他韋(Oseltamivir)、甲氧芐啶(Trimethoprim)、磺胺二甲異嘧啶(Sulfisomidine)、磺胺醋酰(Sulfacetamide)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺吡啶(Sulfapyridine)、磺胺噻唑(Sulfathiazole)、磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine)、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine)、磺胺甲氧嗪(Sulfamethoxypyridazine)、磺胺惡唑(Sulfamoxol)、磺胺甲氧嘧啶(Sulfameter)、磺胺間甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine)、磺胺氯噠嗪(Sulfachloropyridazine)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(Sulfadoxine)、磺胺甲基異惡唑(Sulfamethoxazole)、磺胺異惡唑(Sulfisoxazole)、磺胺苯酰(Sulfabenzamide)、磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine)、磺胺喹沙啉(Sulfaquinoxaline)、磺胺苯吡唑(Sulfaphenazole)、磺胺甲二唑(Sulfamethizole)、磺胺吡唑(Sulfapyrazole)、羥基甲硝唑(1H-Imidazole-1-ethanol)、2-甲硝咪唑(2-Methyl-5-nitroimidazole)、羥甲基甲硝咪唑(1-Methyl-5-nitro-1H-imidazole-2-methanol)、甲硝唑(Metronidazole)、洛硝噠唑(Ronidazole)、地美硝唑(Dimetridazole)、苯硝咪唑(Benzimidazole)、異丙硝唑(Ipronidazole)、奧硝唑(Ornidazole) 純度均大于98%,德國(guó)Dr.E公司;雞蛋 來自廣西多個(gè)地市(包括南寧市、桂林市、柳州市、百色市等11個(gè)地區(qū))共82批,所有雞蛋均取可食用部分,絞碎均質(zhì)(3000 r/min,2 min)后,-20 ℃冷凍保存。

島津20A高效液相色譜儀 日本島津公司;API 4500 Q-TRAP三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)AB公司;OSAKA SODA CAPCELL PAK MGIII-H色譜柱(2.0×100 mm,3 μm) 日本大曹三耀公司;氮吹儀 北京八方世紀(jì)公司;氮?dú)獍l(fā)生器 英國(guó)PEAK公司;高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司;渦旋振蕩器 德國(guó)HEIDOLPH公司;Milli-Q超純水器 法國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 稱取2.00 g(精確到0.01 g)混勻的蛋液于50 mL聚丙烯離心管中,加入4 mL水和10 mL乙腈,混勻后再加入鹽包,迅速振搖2 min,在4 ℃條件下離心(10000 r/min)5 min,取2.0 mL上清液,加入多壁碳納米管-固相萃取(MWCNTs-C18-PSA)組合(10 mg MWCNTs+25 mg PSA+25 mg C18),渦旋30 s后,4600 r/min離心5 min,取1.0 mL 40 ℃水浴氮吹濃縮至近干,加10%乙腈定容至1 mL,渦旋混勻,用微孔濾膜(0.22 μm)過濾,取續(xù)濾液,用于測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 分別稱取44種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量,用乙腈溶解并定容,配成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃條件下保存,有效期一個(gè)月。

1.2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液 分別吸取適量(氯霉素類、氟蟲腈類、抗病毒類、磺胺類、硝基咪唑類)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL),用乙腈配成標(biāo)準(zhǔn)中間液(1 μg/mL);精密量取44種標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1、0.5、1.0 mL分別置于10 mL量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,混勻(質(zhì)量濃度分別為10、50、100 ng/mL),為標(biāo)準(zhǔn)使用液①～③,精密量取44種標(biāo)準(zhǔn)中間液1.0 mL置于10 mL離心管中,氮吹至近干,用乙腈溶解轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中并定容至刻度(質(zhì)量濃度為500 ng/mL),為標(biāo)準(zhǔn)使用液④,于-20 ℃冰箱中保存,有效期2周。

1.2.2.3 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 取空白樣品10份,照1.2.1提取,得到空白基質(zhì)溶液,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1、5、25、50、100、200 ng/mL基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,于4 ℃條件下保存。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:OSAKA SODA CAPCELL PAK MGIII-H色譜柱(2.0 mm×100 mm,3 μm);流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水,B為0.1%甲酸甲醇;進(jìn)樣量:2 μL,流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃。梯度洗脫條件:0～15.0 min,2% B→50% B;15.0～21.0 min,50% B→90% B;21.0～23.0 min,90% B;23.0～23.1 min,90% B→2% B;23.1～25.0 min,2% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件 采用ESI源,正離子、負(fù)離子同時(shí)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè),氣簾氣壓力(CUR)241.325 kPa,正離子:噴霧電壓(IS)4500 V,離子源溫度(TEM)550 ℃,入口電壓(EP)10 V,碰撞室出口電壓(CXP)12 V;負(fù)離子:噴霧電壓(IS)-4500 V,離子源溫度(TEM)550 ℃,入口電壓(EP)-10 V,碰撞室出口電壓(CXP)-8 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MultiQuant和Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子對(duì)、質(zhì)譜采集參數(shù)、保留時(shí)間,見表1,其中以化合物的色譜保留時(shí)間和兩對(duì)MRM離子對(duì)進(jìn)行定性,定量MRM離子對(duì)的峰面積進(jìn)行定量。優(yōu)化后質(zhì)譜條件的正負(fù)離子模式總離子流圖如圖1所示。

續(xù)表

續(xù)表

圖1 負(fù)離子模式(A)分析7種藥物和正離子模式(B)分析37種藥物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of the 7 drugs in negative ion mode(A)and the 37 drugs in positive ion mode(B)注:圖中峰注釋數(shù)字與表1中各數(shù)字所代表的化合物一致。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究選擇色譜柱1(OSAKA SODA CAPCELL PAK MGIII-H,2.0 mm×100 mm,3 μm)、色譜柱2(ACQUITY UPLC BEH C18,2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、色譜柱3(Thermo Hypersil GOLD,2.1 mm×100 mm,1.9 μm)和色譜柱4(Agilent SB-Aq RRHD,2.1 mm×100 mm,1.8 μm)對(duì)44種藥物進(jìn)行分離。結(jié)果顯示,在相同色譜條件下,色譜柱1的響應(yīng)值較高,形成的色譜峰峰形尖銳,對(duì)稱性好,分離效果較佳,雜質(zhì)干擾小,對(duì)磺胺甲氧嗪、磺胺甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶三個(gè)同分異構(gòu)體化合物的分離效果較其它三根色譜柱好,因此選擇色譜柱1為分析柱,具體見圖2。

圖2 磺胺甲氧嗪、磺胺甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶在相同流動(dòng)相體系不同色譜柱中的色譜圖Fig.2 Chromatograms of sulfamethoxypyridazine,sulfameter and sulfamonomethoxine in different columns of the same mobile phase system

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

2.3.1 有機(jī)相選擇 本研究中有三組同分異構(gòu)體,分別為金剛乙胺和美金剛、磺胺惡唑和磺胺異惡唑、磺胺甲氧嗪、磺胺甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶,同分異構(gòu)體的碎片離子質(zhì)量數(shù)存在高度的一致性,因此在LC-MS/MS分析時(shí)存在互相干擾。本研究通過改變流動(dòng)相組成發(fā)現(xiàn),在相同梯度條件下,采用乙腈作為有機(jī)相時(shí),洗脫能力強(qiáng)導(dǎo)致出峰較快,同分異構(gòu)體無法分離,而使用甲醇為流動(dòng)相時(shí),甲醇的極性、洗脫能力弱于乙腈,同分異構(gòu)體間的分離度得到改善,色譜圖見圖3。

圖3 金剛乙胺和美金剛標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of rimantadine and diamond standard solutions注:A:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水;B:0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水;峰注釋數(shù)字與表1中各數(shù)字所代表的化合物一致。

2.3.2 水相的選擇 流動(dòng)相中加入酸是為了給化合物在正離子模式下更好的提供質(zhì)子,為使整個(gè)分析過程中酸度保持相對(duì)穩(wěn)定,故在流動(dòng)相A和流動(dòng)相B中均添加了甲酸。水相分別添加0.1%甲酸、5 mmol/L甲酸銨、5 mmol/L甲酸銨(0.025%甲酸)、5 mmol/L甲酸銨(0.05%甲酸)、5 mmol/L甲酸銨(0.1%甲酸),實(shí)驗(yàn)表明,水相為0.1%甲酸溶液時(shí),各峰型及分離度最佳。具體色譜圖見圖4。

圖4 不同流動(dòng)相比例時(shí)MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram with different mobile phase proportions注:A:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水;B:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸銨;C:0.1%甲酸甲醇-5 mmol/L甲酸銨(0.025%甲酸);D:0.1%甲酸甲醇-5 mmol/L甲酸銨(0.05%甲酸);E:0.1%甲酸甲醇-5 mmol/L甲酸銨(0.1%甲酸)。

2.4 樣品前處理方法優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑 雞蛋的蛋黃和蛋清都是可食用部分,由于所分析的5類化合物極性不同,在蛋黃與蛋清中的分布不同,故需將兩者混合均勻。藥物殘留分析常用溶劑包括乙腈-水-緩沖液、甲醇-水-酸、乙腈-水-酸等,乙腈對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)沉淀效果,故本研究比較了1.0%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈、70%的乙腈提取效果,結(jié)果表明,70%乙腈提取液最澄清,且無油脂漂浮,回收率依次為70%乙腈>1%甲酸乙腈>1.0%乙酸乙腈>5%甲酸乙腈,見表2,故選擇70%乙腈作為提取溶劑,去除蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)。

表2 不同提取溶劑回收率Table 2 Recovery in different solvent

2.4.2 凈化方法 本實(shí)驗(yàn)用MWCNTs、PSA、C18作為吸附劑。MWCNTs主要去除色素、糖等大分子物質(zhì),PSA可以去除酸性物質(zhì)、糖類和碳水化合物,C18可以去除脂肪、油脂和非極性化合物[22]。

雞蛋中富含蛋白質(zhì)和脂肪,還有核黃素,這些雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定產(chǎn)生較大干擾,首先考察了MWCNTs、PSA、C18對(duì)色素的吸附效果,在2 mL提取液分別加入50 mg MWCNTs、50 mg PSA和50 mg C18,實(shí)驗(yàn)表明,色素的吸附效果依次為MWCNTs>C18>PSA。由于MWCNTs的結(jié)構(gòu)特性,在去除干擾物的同時(shí)也吸附目標(biāo)化合物,因此本實(shí)驗(yàn)以回收率作為指標(biāo)對(duì)MWCNTs的用量進(jìn)行考察,當(dāng)MWCNTs用量為10、20、50 mg時(shí),氟蟲腈類的回收率變化不大,氯霉素、抗病毒、磺胺、硝基咪唑類回收率隨著MWCNTs用量的增加而減小,見圖5,說明MWCNTs對(duì)目標(biāo)化合物有一定的吸附作用。為除去雞蛋中的脂肪、小極性化合物及其它對(duì)目標(biāo)物測(cè)定帶來干擾的物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)分別考察了MWCNTs+PSA、MWCNTs+C18、MWCNTs+PSA+C18不同組合作為凈化劑,結(jié)果表明MWCNTs+PSA+C18組合的凈化效果最佳,基質(zhì)干擾較小,回收率在70%～115%,滿足檢驗(yàn)要求。

圖5 不同MWCNTs用量的回收率Fig.5 Recovery rates of different MWCNTs注:圖中標(biāo)注數(shù)字與表1中各數(shù)字所代表的化合物一致。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 按1.2.2.3操作,結(jié)果R2為0.9909～0.9999,表明44種藥物在0.1～200 ng/mL范圍內(nèi)線性良好,見表1。

2.5.2 檢出限、檢出限和定量限 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.3和1.2.4色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定,以濃度為X軸,峰面積為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,44種藥物的相關(guān)系數(shù)均大于0.991,說明方法線性良好,結(jié)果見表1。在空白樣品中添加已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以3倍和10倍信噪比(S/N)分別計(jì)算44種藥物的方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),LOD為0.007～0.3571 μg/kg,LOQ為0.005～1.190 μg/kg,結(jié)果見表3。

表3 44種藥物殘留加標(biāo)回收、精密度及LOD、LOQ(n=6)Table 3 Recovery,precision,LOD and LOQ of 44 drug residues(n=6)

2.5.3 回收率和精密度 取2.00 g樣品,置于50 mL聚丙烯離心管中,分別添加0.02 mL 10 ng/mL、0.2 mL 100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和0.2 mL 500 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,照1.2.1方法操作,得到加標(biāo)溶液,分別對(duì)每個(gè)添加水平進(jìn)行平行測(cè)試6次,計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。各化合物的回收率為77.9%～114.5%,符合多殘留分析要求,見表3。

2.5.4 實(shí)際樣品的測(cè)定 采用本研究方法對(duì)廣西11個(gè)地市共82批次雞蛋進(jìn)行藥物殘留篩查,結(jié)果檢出9批次雞蛋含有磺胺甲基異惡唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧芐啶、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝唑、金剛烷胺和氟苯尼考,與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 22338-2008 《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定》、SN/T 4253-2015 《出口動(dòng)物組織中抗病毒類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜 質(zhì)譜法》、GB/T 21316-2007 《動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》、SN/T 1928-2007 《進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果見表4,本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～9.7%,表明本研究方法數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表4 本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果比較Table 4 Comparison of the results betweenthis method and the standard method

3 結(jié)論

本研究采用改進(jìn)的多壁碳納米管-QuEChERS方法建立了LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定雞蛋中氯霉素、氟蟲腈、抗病毒、磺胺、硝基咪唑5類共44種藥物殘留量的高通量篩查方法,測(cè)定多類藥物殘留,簡(jiǎn)單快速,節(jié)約檢驗(yàn)成本與檢驗(yàn)周期,凈化效果好,靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高,彌補(bǔ)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)分類檢測(cè)的不足,適應(yīng)日常大批量的雞蛋中藥物殘留的監(jiān)管,為獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)修訂提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。