陳 涵,陶 陽,吳 越,羅鑫濤,韓永斌

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

藍(lán)莓(Vacciniumspp.),為杜鵑花科、越橘屬被子植物的漿果,具有多種營養(yǎng)和保健功能。藍(lán)莓中含有多酚類(如花色苷)、熊果酸等生物活性成分,具有保護(hù)視力、抗氧化、預(yù)防和治療心血管疾病等保健功能[1]。藍(lán)莓常被制成果汁和酒,在加工過程中產(chǎn)生的藍(lán)莓渣常被當(dāng)作加工廢棄物丟棄,不僅造成資源的浪費,也成為一種環(huán)境污染物。因此,采用合適的方法將藍(lán)莓渣中功能性成分提取出來,對于保護(hù)環(huán)境、資源再利用及藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

花色苷是藍(lán)莓及其渣中的主要功能性物質(zhì)[2]。對植物提取物中的活性成分進(jìn)行富集和純化是工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟[3],常用的純化手段有柱層析技術(shù)[4]、高效液相色譜技術(shù)[5]等。這些方法代價較高,不利于大量制備花色苷的精提物,因此需要更為簡單、廉價的提純工藝。吸附已被大量研究證實是一種有效的花色苷提純方法,常用于酚類吸附的吸附劑有活性炭、天然礦物(如硅質(zhì)材料、粘土和天然沸石)、樹脂、生物吸附劑(如酵母、乳酸菌)等[6]。Yang等[7]研究了9種大孔樹脂對覆盆子中花色苷的分離純化,結(jié)果表明,在所選大孔樹脂中,AB-8大孔樹脂對花色苷的吸附和解吸性能最好;Luís等[8]研究了不同理化性質(zhì)的活性炭對紅酒進(jìn)行處理后紅酒中酚類化合物的變化,結(jié)果表明活性炭對紅酒中酚類化合物有一定的吸附能力;Rizzo等[9]使用高效液相色譜法測定了酵母吸附的酚類物質(zhì),并闡明了酵母與葡萄中特定酚類物質(zhì)相互作用的機(jī)理;Marsal等[10]使用有機(jī)膨潤土吸附含羞草提取物中多酚,結(jié)果表明有機(jī)膨潤土可以有效除去廢水中多酚。

作為一種常見的非熱加工技術(shù),超聲波被廣泛應(yīng)用于強(qiáng)化食品加工傳質(zhì)過程,如提取[11]、吸附[12]等過程。有研究表明,超聲波可以提高吸附能力,其主要機(jī)理是超聲空穴效應(yīng)引起的一系列物理化學(xué)變化,包括氣泡的形成與破裂,形成表面空隙等[13]。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)超聲波可以促進(jìn)樹脂XAD-16對蘋果皮多酚的吸附與解吸過程,還能增強(qiáng)樹脂的吸附能力。Tao等[14]研究表明超聲波能增強(qiáng)廢棄酵母對果渣提取物中酚類的吸附。但是,超聲波對不同類型的吸附劑吸附性能的影響可能存在差異,因此,有必要比較不同種類吸附劑在超聲波作用下吸附花色苷的特性。

本研究選取了大孔樹脂XAD-7HP、釀酒酵母、活性炭、膨潤土這四種常見的花色苷吸附劑,將其用于吸附藍(lán)莓渣花色苷,比較超聲波輔助與水浴振蕩條件對花色苷吸附過程的影響,進(jìn)而進(jìn)行動力學(xué)方程擬合,并通過紅外光譜鑒定不同吸附劑中參與吸附過程的官能團(tuán),旨在篩選出較適合用于超聲波強(qiáng)化藍(lán)莓渣花色苷吸附的吸附劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓(品種‘Garden blue’) 江蘇省南京市溧水藍(lán)莓種植基地,榨汁得到的藍(lán)莓渣于-18 ℃貯藏;大孔樹脂(20～60目,XAD-7HP) Solarbio技術(shù)有限公司;啤酒活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;活性炭 南京壽德實驗器材有限公司;膨潤土 上海試四赫維化工有限公司;溴化鉀(光譜純) 上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為分析純。

IR100傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司;DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器 太倉市強(qiáng)樂實驗設(shè)備有限公司;DC-0506恒溫水浴系統(tǒng)(中國南京) 南京凡帝朗信息科技有限公司;20 kHz超聲探頭系統(tǒng);玻璃柱 I.D.×L:30×150 mm,南京壽德實驗器材有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍(lán)莓渣中花色苷的提取 參照Cui等[15]的方法并稍作修改。藍(lán)莓渣在25 ℃避光解凍24 h,稱取30 g藍(lán)莓渣,按料液比1∶10 g/mL浸漬于體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇水溶液中,用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0。30 ℃、120 r/min磁力攪拌浸提12 h后,4390 g離心10 min,收集上清液。其后,40 ℃下真空濃縮花色苷粗提液至原體積的1/2,充分除去乙醇后將藍(lán)莓渣花色苷提取液置于-18 ℃下貯藏備用。

1.2.2 吸附劑的預(yù)處理 大孔樹脂:參照Timothy等[16]的方法對大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理。將樹脂填充在玻璃柱(I.D.×L:30×150 mm)中,先用200 mL的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇水溶液洗滌,再用200 mL去離子水洗脫,之后采用200 mL 4%的鹽酸洗脫。然后利用去離子水清洗樹脂,直到其為中性,再采用200 mL體積分?jǐn)?shù)5%的NaOH溶液對樹脂進(jìn)行漂洗。最后,用去離子水沖洗樹脂,直到洗脫液的pH達(dá)到7.0。將上述樹脂在60 ℃下進(jìn)行真空干燥,直至達(dá)到恒重。

活性炭膨潤土:60 ℃下進(jìn)行真空干燥至達(dá)到恒重;釀酒酵母:于40 ℃下進(jìn)行真空干燥至達(dá)到恒重。

1.2.3 水浴振蕩與超聲波輔助吸附

1.2.3.1 水浴振蕩吸附 參照陶莎等[17]的方法并稍作修改。稱取500 mg吸附劑于100 mL錐形瓶中,加入50 mL藍(lán)莓渣提取液(花色苷濃度為160 mg/L、pH2.0),在30 ℃、100 r/min條件下分別采用大孔樹脂XAD-7HP、釀酒酵母、活性炭、膨潤土進(jìn)行吸附,吸附時間分別是240、150、180、30 min。在第10、20、30、45、60、90、120、150、180、210、240 min吸取樣液500 μL(膨潤土因前30 min吸附已經(jīng)達(dá)到平衡,故本文只選擇前30 min的圖像),以6740×g離心5 min,收集上清液并測定其中總花色苷含量以計算吸附量,以時間為橫軸,相應(yīng)時刻的花色苷吸附量為縱軸,繪制吸附動力學(xué)曲線。

1.2.3.2 超聲波輔助吸附 稱取500 mg吸附劑(大孔樹脂XAD-7HP、釀酒酵母、活性炭、膨潤土)于100 mL錐形瓶中,加入50 mL藍(lán)莓渣提取液(花色苷濃度為160 mg/L、pH2.0),在30 ℃和超聲強(qiáng)度106 W/L條件下吸附,后續(xù)處理同水浴振蕩吸附(膨潤土因前30 min吸附已經(jīng)達(dá)到平衡,故本文只選擇前30 min的圖像)。

1.2.4 動力吸附模型 采用Lagergren一級動力學(xué)方程(式(1))與二級動力學(xué)方程(式(2))[18]擬合吸附動力學(xué)過程:

qt=qe(1-e-k1t)

1.對聯(lián)并非高不可攀，更非古人專利，小孩子也能創(chuàng)作對聯(lián)，關(guān)鍵是師生是否愿意去做，肯否花時間去琢磨。寫對聯(lián)花費時間不多，在校期間老師也可以抽出點時間，引導(dǎo)學(xué)生去嘗試練筆。

式(1)

式(2)

式中:qt為t時刻的花色苷吸附量(mg/g);qe為花色苷的平衡吸附量(mg/g);t為吸附時間(min);k1為一級動力學(xué)速率常數(shù)(min-1);k2為二級動力學(xué)速率常數(shù)(g/(mg·min))。

1.2.5 分析與測定方法

1.2.5.1 花色苷含量和吸附量的測定 參照Vialeta等[19]的方法用分光光度計測定總花色苷含量。將乙醇、水和鹽酸按體積比69∶30∶1混勻制成稀釋液,對樣品進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋后在540 nm波長處測定吸光值(A540)?？偦ㄉ蘸恳运{(lán)莓渣提取液中含有的錦葵色素-3-葡萄糖苷當(dāng)量計,按公式(3)計算:

總花色苷質(zhì)量濃度(mg/L)=A540×16.7×d

式(3)

式中:16.7為摩爾消光系數(shù);d表示樣品的稀釋倍數(shù)。

花色苷吸附量計算參考袁亞宏等[20]的方法,見公式(4):

式(4)

式中:qt為t時刻吸附劑對花色苷的吸附量(mg/g);c0為藍(lán)莓渣花色苷提取液的初始質(zhì)量濃度(mg/L);ct為提取液t時刻的質(zhì)量濃度(mg/L);V為溶液總體積(mL);m為吸附劑質(zhì)量(mg)。

1.2.5.2 吸附前后吸附劑紅外光譜變化 將花色苷提取液、未吸附藍(lán)莓渣花色苷的吸附劑和在超聲條件下吸附花色苷至平衡的吸附劑于-47 ℃冷凍干燥72 h,以完全除去樣品中水分。將1 mg待測樣與100 mg KBr混合,充分研磨,用壓片機(jī)壓成透明薄片。在紅外區(qū)域下從4000至400 cm-1掃描樣品,分析花色苷粗提物中官能團(tuán)和吸附前后吸附劑表面化學(xué)官能團(tuán)的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復(fù)3次,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示,采用Origin 2017軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,采用SAS 8.0的LSD進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 水浴振蕩與超聲波輔助吸附藍(lán)莓渣花色苷的吸附動力學(xué)曲線

圖1a顯示,隨著吸附時間延長,大孔樹脂的花色苷吸附量逐漸增加,前60 min吸附速率較快,之后逐漸降低,90 min之后,超聲波輔助下大孔樹脂的花色苷吸附量顯著高于水浴振蕩(P<0.05)。在240 min,水浴振蕩條件下的吸附量為13.45 mg/g,超聲波輔助大孔樹脂XAD-7HP對花色苷的吸附量提高了8.62%,為14.61 mg/g。Wang等[12]比較了不同強(qiáng)度超聲波(0～400 W)對樹脂XAD-16吸附蘋果皮多酚過程的影響,發(fā)現(xiàn)超聲波成功提高了樹脂XAD-16吸附蘋果皮多酚的吸附量,指出超聲波空穴效應(yīng)引起的傳質(zhì)加速可能是提高吸附劑吸附量的主要原因,本實驗同樣發(fā)現(xiàn)超聲波可以提高大孔樹脂XAD-7HP對藍(lán)莓渣花色苷的吸附量,因此該原因可能也是本研究中超聲波提高花色苷吸附量的原因之一。

圖1 水浴振蕩和超聲波輔助不同吸附劑吸附藍(lán)莓渣花色苷的吸附動力學(xué)曲線Fig.1 Adsorption kinetic curves of anthocyanins by different adsorbentsunder the condition of water-bath oscillation and with the help of an ultrasound注:a：大孔樹脂吸附;b:釀酒酵母吸附;c:活性炭吸附;d:膨潤土吸附。

由圖1b可知,超聲波輔助作用下,吸附前10 min酵母完成了吸附總量的72.85%,隨后吸附速率逐漸降低。超聲波輔助下釀酒酵母的花色苷吸附量顯著高于水浴振蕩(P<0.05)。150 min時,相比于水浴振蕩條件下的吸附量4.96 mg/g,超聲波輔助釀酒酵母的吸附量提高了19.56%,為5.93 mg/g。Tao等[14]用超聲波提高了廢棄酵母對果渣中酚類的吸附效率,這與本研究中超聲波處理增加了釀酒酵母對藍(lán)莓渣花色苷的吸附量一致,其機(jī)理可能是空穴效應(yīng)促進(jìn)了酚類化合物在酵母顆粒周圍的運動,增強(qiáng)了二者的結(jié)合能力,有利于多酚滲透進(jìn)入酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,從而改善吸附過程。

圖1c顯示,吸附前10 min,在超聲波輔助和水浴振蕩的條件下,活性炭分別完成了吸附總量的77.79%和68.38%,隨后吸附速率逐漸降低。同時,超聲波輔助下活性炭對花色苷的吸附量顯著高于水浴振蕩(P<0.05)。在180 min,相比于水浴振蕩,超聲波作用下活性炭的吸附量提高11.90%,為13.73 mg/g。

由圖1d可知,膨潤土對花色苷的吸附在10 min時達(dá)到吸附平衡,達(dá)到平衡的時間顯著低于以上三種吸附劑吸附的平衡時間,這可能與膨潤土和藍(lán)莓渣花色苷自身的結(jié)構(gòu)特性和二者的相互作用有關(guān)。超聲波輔助下膨潤土對花色苷吸附量顯著高于水浴振蕩的吸附量(P<0.05)。達(dá)到吸附平衡時,相比于水浴振蕩下的平衡吸附量9.95 mg/g,超聲波輔助下膨潤土的花色苷吸附量提高了16.48%,為11.59 mg/g。

四種吸附劑中大孔樹脂XAD-7HP對藍(lán)莓渣花色苷的吸附量最大,活性炭次之,其次是膨潤土,釀酒酵母的吸附量最小;四種吸附劑中,釀酒酵母在超聲波作用下吸附量提高程度最大,這可能是因為酵母結(jié)構(gòu)較為疏松,超聲波產(chǎn)生的空穴效應(yīng)對其影響較大,使得酵母表面更多的活性位點暴露出來,有利于與花色苷結(jié)合,從而促進(jìn)吸附。

2.2 水浴振蕩與超聲波輔助吸附藍(lán)莓渣花色苷吸附動力學(xué)分析

對水浴振蕩和超聲波輔助下四種吸附材料對花色苷的吸附動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示,在水浴振蕩和超聲輔助下,對于四種吸附劑吸附藍(lán)莓渣花色苷的過程,二級動力學(xué)方程擬合結(jié)果的決定系數(shù)R2均大于一級動力學(xué)方程的決定系數(shù)R2,這說明Lagergren二級動力學(xué)模型能更好地模擬該吸附過程。Chang等[21]、Ana等[22]在研究大孔樹脂XAD-7HP和廢棄酵母對不同植物來源花色苷吸附性能的過程中,同樣發(fā)現(xiàn)二級動力學(xué)模型能更好地擬合吸附劑吸附薔薇花萼與葡萄渣提取物中花色苷的過程。

表1 一級動力學(xué)模型和二級動力學(xué)模型基本參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of pseudo-first order and pseudo-second order models

2.3 吸附前后四種吸附劑的FTIR光譜表征分析

對花色苷粗提物和吸附花色苷前、吸附后的吸附劑進(jìn)行紅外光譜測定,采用Origin 2017軟件進(jìn)行分析,結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同吸附劑傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of different adsorbents注:a:大孔樹脂吸附;b:釀酒酵母吸附;c:活性炭吸附;d:膨潤土吸附。A:吸附前;B:吸附后;C:花色苷粗提物。

在花色苷粗提物的紅外光譜中,1637 cm-1處是花色苷芳香族C=C鍵的伸縮振動,1078 cm-1處是藍(lán)莓渣提取物中糖和酸的C-O伸縮振動[23-24]。

圖2a為吸附前后大孔樹脂的紅外光譜結(jié)果圖。吸附前,大孔樹脂主要存在以下特征吸收峰:1733(C=O的彈性振動)、1473和1392(C-H的彎曲振動)、3566和2979 cm-1(O-H和C-H的伸縮振動)[24-26]。吸附后,1637 cm-1處峰強(qiáng)增強(qiáng),主要是由于花色苷在該波段也存在特征吸收峰,兩者疊加使特征峰更加明顯,也證明了花色苷被成功吸附。2979 cm-1處的吸收峰移動到2973 cm-1處,可能是基于C-H的伸縮振動,1473和1392 cm-1處的吸收峰分別移動到1471和1390 cm-1處,可能是由于C-H的彎曲振動。3566 cm-1處的吸收峰移動到3446 cm-1處,這說明大孔樹脂表面的酚羥基在吸附過程中發(fā)生位移,可能用于形成氫鍵。

圖2b為吸附前后釀酒酵母的紅外光譜結(jié)果圖。吸附前,釀酒酵母主要存在以下吸收峰:3399(多糖中-NH2和-OH的伸縮振動)、2925(-CH2的對稱和反對稱收縮振動)、1653(蛋白質(zhì)肽鍵中酰胺基團(tuán)Ⅰ帶-C=O-和-NH-的伸縮振動)、1540(酰胺基團(tuán)Ⅱ帶-C=O-NH-的彎曲振動)、1455(-CH2和-CH3重疊反對稱彎曲振動)、1417(-COOH和-OH的彎曲振動)、1243 cm-1(-OH)[27-28]。酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶是蛋白質(zhì)的特征譜帶,這說明蛋白質(zhì)是酵母細(xì)胞的重要成分之一[28]。吸附后,1655和1047 cm-1處吸收峰峰強(qiáng)增加,這可能作為花色苷成功吸附到酵母上的證據(jù)。3399 cm-1處吸收峰移動到3378 cm-1,1653 cm-1處吸收峰移動到1655 cm-1,1540 cm-1處吸收峰移動到1533 cm-1,這表明酵母中的多糖和酰胺基團(tuán)參與了吸附過程,可能是N原子在官能團(tuán)中提供單雙電子,導(dǎo)致基團(tuán)極性改變[27]。1455 cm-1處吸收峰移動到1456 cm-1,表明吸附過程受氫鍵和范德華力影響[27];1417 cm-1處吸收峰移動到1373 cm-1,1243 cm-1處吸收峰移動到1241 cm-1,表明-COOH和-OH參與了吸附過程,可能發(fā)生了氫鍵的位移。

圖2c為吸附前后活性炭的紅外光譜結(jié)果圖。吸附前,活性炭主要存在以下吸收峰和官能團(tuán):1578(芳香族C=C)、1184 cm-1(C-O)[29]。吸附后,1699 cm-1處出現(xiàn)一個新的吸收峰,可能是花色苷中官能團(tuán)與活性炭表面基團(tuán)相互作用形成的,這可能表明花色苷被成功吸附。1578 cm-1處吸收峰移動到1589 cm-1,1184 cm-1處吸收峰移動到1199 cm-1,表明活性炭吸附花色苷過程受C=C和C-O影響;在1436 cm-1處有新的吸收峰出現(xiàn),可能是O-H變形振動或者-CH2變形振動,1519 cm-1處的新吸收峰可能是C=C骨架伸縮振動,這表明花色苷與活性炭表面基團(tuán)結(jié)合,促進(jìn)了新的官能團(tuán)的形成。于富玲[29]在研究活性炭對染料的吸附中表明,染料分子與活性炭上的活性位點進(jìn)行表面配位反應(yīng),使活性炭的紅外光譜發(fā)生變化;此外,活性炭與染料之間還通過范德華力、氫鍵、專屬吸附和電性作用等產(chǎn)生發(fā)生吸附,改變官能團(tuán)的存在形式,影響到相應(yīng)的紅外譜圖。

圖2d為吸附前后膨潤土的紅外光譜結(jié)果圖。吸附前,膨潤土主要存在以下吸收峰和官能團(tuán):796(石英摻雜物)、694(Si-O的變形和彎曲振動)、523和467(Al-O-Si 和Si-O-Si 的彎曲振動)、918(Al-Al-OH)、1039(Si-O的彎曲振動)、3629(游離-OH的伸縮振動)、3448 cm-1(通過氫鍵締合的-OH)[30]。吸附后,1637 cm-1處峰強(qiáng)增強(qiáng),表明花色苷被成功吸附。1039 cm-1處吸收峰移動到1043 cm-1,694 cm-1處吸收峰移動到692 cm-1,這可能是基于Si-O的變形和彎曲振動;原-OH吸收峰發(fā)生移動,分別移至3620和3421 cm-1,李家政等[31]指出能形成氫鍵的基團(tuán)如羰基、羥基、酯基等在形成氫鍵時,其紅外吸收的波數(shù)將會發(fā)生變化,即紅移或藍(lán)移,這表明以上基團(tuán)在吸附過程通過形成氫鍵而發(fā)揮吸附作用,故膨潤土能成功吸附花色苷的原因可能是氫鍵發(fā)生了位移。

比較吸附前后四種吸附劑的紅外光譜變化,可以發(fā)現(xiàn)氫鍵參與了這四種吸附劑吸附花色苷的過程。其中,釀酒酵母在吸附前后結(jié)構(gòu)變化最大,這可能表明超聲作用能較大程度影響釀酒酵母的結(jié)構(gòu),從而改善其吸附性能,該結(jié)果與動力學(xué)研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

四種吸附劑(大孔樹脂XAD-7HP、釀酒酵母、活性炭、膨潤土)在超聲波輔助下花色苷吸附量均顯著高于水浴振蕩下吸附量(P<0.05),這表明超聲波對這四種吸附劑吸附藍(lán)莓渣花色苷均有促進(jìn)作用。吸附量大小為大孔樹脂>活性炭>膨潤土>釀酒酵母,其中超聲作用對釀酒酵母的吸附能力提高程度最大,提高了19.56%。在30 ℃ 106 W/L超聲波輔助和100 r/min水浴振蕩條件下的吸附動力學(xué)行為表明,二級動力學(xué)模型能更好地擬合四種吸附材料對藍(lán)莓渣花色苷的吸附過程。紅外分析得知大孔樹脂表面的酚羥基可能用于形成氫鍵,在吸附過程中發(fā)揮重要作用;釀酒酵母細(xì)胞中的多糖和酰胺基團(tuán)參與了吸附過程,氫鍵和范德華力也參與其中;活性炭在吸附后出現(xiàn)了一些新的官能團(tuán)(O-H、-CH2、C=C),這可能與花色苷與活性炭表面基團(tuán)相互作用有關(guān);氫鍵也參與了膨潤土對花色苷的吸附過程,故氫鍵在這四種吸附劑對藍(lán)莓渣花色苷的吸附過程中均發(fā)揮著作用。綜上所述,在超聲波輔助四種吸附劑吸附藍(lán)莓渣花色苷的過程中,樹脂有著最大吸附量,超聲波對釀酒酵母吸附量的提高程度最大;從吸附效率角度考慮,大孔樹脂是較適宜的吸附劑。