(接上期)
3.3.3 鑒別診斷 非洲豬瘟的臨床表現(xiàn)多樣,嚴(yán)重程度也不一樣,ASF 臨床癥狀與古典豬瘟(CSF)、豬丹毒癥、沙門氏菌病、放線桿菌病、其他敗血癥、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)的臨床癥狀非常類似,有時(shí)候容易混淆(詳見表1)。
3.3.4 發(fā)現(xiàn)疑似病例需采取的行動(dòng) 發(fā)現(xiàn)疑似病例,應(yīng)立即按照《非洲豬瘟防治技術(shù)規(guī)范》和《非洲豬瘟疫情應(yīng)急預(yù)案》要求上報(bào)疫情。
3.4 樣品采集
3.4.1 采樣方法 有效而準(zhǔn)確地采集ASF 樣品是實(shí)現(xiàn)ASF 快速精準(zhǔn)檢測的關(guān)鍵步驟。當(dāng)疫情暴發(fā)(被動(dòng)監(jiān)測)時(shí),應(yīng)針對(duì)患病豬、死亡豬及豬舍環(huán)境進(jìn)行采樣;而在常規(guī)監(jiān)測時(shí),應(yīng)對(duì)ASFV易感豬群及環(huán)境(如出豬臺(tái)、場區(qū)大門等風(fēng)險(xiǎn)較大的地方)進(jìn)行采樣;如果是針對(duì)精準(zhǔn)清除的群體,采樣的數(shù)量可以適當(dāng)加大。采樣應(yīng)注意避免交叉污染,并在采集每頭豬只后更換一次性手套。觸碰豬只、料槽、欄桿后,應(yīng)及時(shí)更換一次性手套。采血時(shí),必須做到每采集1 頭豬只更換1 個(gè)新的針頭,以免造成ASFV 傳播。提交到診斷實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)樣品應(yīng)有清晰且保存持久的標(biāo)簽,樣品質(zhì)量良好。所有采樣后的防護(hù)用品必須經(jīng)焚燒或高壓處理。
3.4.2 樣品類型
3.4.2.1 口鼻拭子 將每頭豬口、鼻拭子收集于同一采樣管中,以便提高檢測的準(zhǔn)確性和減少工作量。拭子裝于Eppendorf管內(nèi),建議將樣品保存于4 ℃,立刻送檢,沒有實(shí)驗(yàn)條件的應(yīng)在24 h內(nèi)送至有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室。
3.4.2.2 全血 采血過程中應(yīng)保持無菌操作。采血前,先用酒精棉對(duì)采血部位進(jìn)行局部消毒。采血完畢,進(jìn)行局部消毒并用干棉球按壓止血。使用含有抗凝血?jiǎng)‥DTA-紫色蓋)的真空采血管從頸靜脈、前腔靜脈或耳緣靜脈抽取全血。如果動(dòng)物已經(jīng)死亡,可立即從心臟中采血。避免使用含肝素的真空采血管(綠色蓋子)。
3.4.2.3 血清 使用未加抗凝劑(紅色蓋子)的真空采血管從頸靜脈、前腔靜脈、耳緣靜脈采血,或剖檢過程收集血液樣品。靜置分離后,收集血清。如果血清是紅色,表明樣品發(fā)生了溶血。通常已經(jīng)死亡動(dòng)物的血液樣品易發(fā)生溶血。
血清樣品在分離后可以立即開展檢測,如果需要儲(chǔ)存,對(duì)于抗體檢測,儲(chǔ)存在-20 ℃,但是對(duì)于病毒檢測,最好儲(chǔ)存于-80 ℃。
3.4.2.4 器官和組織樣品 可采集脾臟、淋巴結(jié)、肝臟、扁桃體、心臟、肺和腎臟樣品。脾臟和淋巴結(jié)的病毒含量最高。對(duì)于死亡時(shí)間較長的動(dòng)物,可采集骨髓樣品,也可采集關(guān)節(jié)內(nèi)組織液。建議將樣品保持在4 ℃,盡快提交給實(shí)驗(yàn)室。如無法及時(shí)送樣,可將樣品儲(chǔ)存在冷庫或液氮中。樣品用10%緩沖福爾馬林浸泡30 min 以上,病毒可被滅活,可用于PCR檢測。
表1 非洲豬瘟與其他相似豬病的鑒別診斷
樣品的最小需求量:血清1 mL;全血1 mL;組織樣品10 g。
3.4.2.5 環(huán)境樣品 可多點(diǎn)采集養(yǎng)殖場軟蜱等媒介和環(huán)境拭子,如糞便、泔水、飼料等。
3.4.2.6 其他環(huán)境樣品 以區(qū)塊為單位,按風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行區(qū)域采樣。豬場內(nèi)所有墻體、地面、設(shè)備等表面進(jìn)行全覆蓋采樣。
生產(chǎn)區(qū)內(nèi):包括各區(qū)間豬舍內(nèi)所有區(qū)間單元墻體、地面、風(fēng)機(jī)、地溝、設(shè)備、水線、料線、門、窗、濕簾、飲用水等。采樣應(yīng)全覆蓋包括死角、料槽底部等不易采集到的位置。
生產(chǎn)區(qū)外:對(duì)可能的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域進(jìn)行采樣,包括地面、草坪、風(fēng)機(jī)口、污水池、發(fā)酵大棚、出豬臺(tái)、場區(qū)大門、料塔、下水道、員工宿舍、儲(chǔ)物間、浴室、辦公室、餐廳廚房、車輛、水源等所有可能受到污染的區(qū)域。
場周邊區(qū):豬場周圍道路。
建議所有樣品在4 ℃以下保存。
3.4.2.7 軟蜱等媒介樣品 鈍緣蜱可以用于檢測ASFV。有三種收集技術(shù):手動(dòng)收集、二氧化碳誘捕和真空吸引捕捉。收集后,應(yīng)讓蜱保持存活或直接儲(chǔ)存在液氮中,避免DNA降解。
3.4.3 發(fā)生ASF后豬場復(fù)養(yǎng)前的采樣要點(diǎn)
3.4.3.1 采樣位點(diǎn)
(1)全覆蓋采樣:以區(qū)塊為單位,對(duì)其內(nèi)部所有墻體、地面、設(shè)備等表面進(jìn)行全覆蓋采樣。
(2)重點(diǎn)位點(diǎn)采樣:作為全覆蓋采樣方法的補(bǔ)充,包括死角、料槽底部等不容易采集到的位置。
3.4.3.2 采樣時(shí)間點(diǎn)
(1)初步清洗完成后采樣檢測,了解當(dāng)前具體污染程度,并為下一步清洗消毒工作提供參考。
(2)徹底清洗完成后采樣檢測,評(píng)估清洗效果。
(3)消毒后采樣檢測(細(xì)菌培養(yǎng)+ASFV核酸檢測),評(píng)估消毒效果。
(4)后備豬全面進(jìn)場前采樣檢測。
(5)復(fù)檢檢測。
3.4.3.3 哨兵豬的使用
(1)哨兵豬實(shí)驗(yàn),是成功復(fù)產(chǎn)的關(guān)鍵。哨兵豬實(shí)驗(yàn)的步驟:選擇一部分動(dòng)物;實(shí)驗(yàn)室檢測確認(rèn)這些動(dòng)物無非瘟病毒和其他主要豬病病原;安排運(yùn)輸,確保運(yùn)輸車輛非瘟病毒陰性;征召愿意在場內(nèi)封閉生活60 d的員工;向場內(nèi)運(yùn)送足夠60 d 使用的飼料;實(shí)驗(yàn)室檢測確認(rèn)飼料和水都是非瘟病毒陰性;運(yùn)送動(dòng)物(數(shù)量約為正常生產(chǎn)時(shí)的5%~10%);運(yùn)送用的卡車應(yīng)該清洗、消毒并在近期內(nèi)停止使用。
(2)哨兵豬的檢測:哨兵豬飼養(yǎng)期間,進(jìn)行三次檢測,分別在15d、30 d、60 d進(jìn)行病原學(xué)檢測,哨兵豬檢測合格且無臨床癥狀的豬場,才可以考慮進(jìn)行復(fù)養(yǎng)。
3.5 樣品的記錄、保存、包裝和運(yùn)送
3.5.1 注意事項(xiàng) 為保證準(zhǔn)確診斷,必須在適當(dāng)溫度下以最快速度將樣品仔細(xì)包裝,做好標(biāo)記和相關(guān)記錄,以最快路線送到最近的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指定的實(shí)驗(yàn)室。樣品運(yùn)輸必須遵守農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動(dòng)物病原微生物菌(毒)種運(yùn)輸包裝規(guī)范》等規(guī)定。
采樣之前必須致電相關(guān)實(shí)驗(yàn)室,確保遵循正確的樣品提交程序,保證所送樣品能在第一時(shí)間完成檢測及儲(chǔ)存。
做好樣品運(yùn)輸過程中的安全保障工作,避免在運(yùn)輸途中感染其他動(dòng)物,避免樣品被污染。
運(yùn)送的樣品必須附有足夠數(shù)量的冷卻材料(如冰袋),以防變質(zhì)。
3.5.2 采樣信息記錄
3.5.2.1 采樣同時(shí),應(yīng)填寫采樣單;采樣單應(yīng)用鋼筆或簽字筆逐項(xiàng)填寫(一式三份);樣品標(biāo)簽和封條應(yīng)用簽字筆填寫;保溫容器外封條應(yīng)用鋼筆或簽字筆填寫;小塑料離心管上可用記號(hào)筆做標(biāo)記;應(yīng)將采樣單和病史資料裝在塑料包裝袋中,并隨樣品送實(shí)驗(yàn)室,每個(gè)樣品能對(duì)應(yīng)到來源動(dòng)物。
3.5.2.2 樣品信息至少應(yīng)包括以下內(nèi)容:畜主姓名和養(yǎng)殖場地址;養(yǎng)殖場飼養(yǎng)動(dòng)物品種及數(shù)量;疑似或被感染動(dòng)物或易感動(dòng)物種類及數(shù)量;首發(fā)病例和繼發(fā)病例的日期;感染動(dòng)物在畜群中的分布情況;死亡動(dòng)物數(shù)、出現(xiàn)臨床癥狀的動(dòng)物數(shù)量及年齡;臨床癥狀及其持續(xù)時(shí)間,死亡情況和時(shí)間等;飼養(yǎng)類型和標(biāo)準(zhǔn),包括飼料來源等;送檢樣品清單和說明,包括病料種類、保存方法等;動(dòng)物免疫和治療史;送檢者的姓名、地址、郵編、電話和郵箱;送檢日期;采樣人和被采樣單位簽章。
3.5.3 樣品包裝要求
3.5.3.1 采集好的樣品應(yīng)仔細(xì)進(jìn)行包裝,做好標(biāo)記并送到實(shí)驗(yàn)室。樣品應(yīng)使用“三重包裝系統(tǒng)”,并正確標(biāo)記,以防止泄漏,內(nèi)附采樣單。保障運(yùn)輸過程中的生物安全,并避免樣品受到污染。
3.5.3.2 直接盛裝容器。樣品應(yīng)該儲(chǔ)存在密封、無菌的主容器中,根據(jù)檢驗(yàn)樣品性狀及檢驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的容器。每個(gè)樣品容器外應(yīng)做好標(biāo)記,注明樣品名、樣品編號(hào)、采樣日期等,要能明確識(shí)別來自于哪只動(dòng)物。
3.5.3.3 二次包裝。吸收材料也應(yīng)放置在二次容器內(nèi)。如果將多個(gè)易碎的主容器放置在單個(gè)二次容器中,則必須單獨(dú)包裝或分離,以防止相互接觸。二次包裝容器應(yīng)貼封條,封條上應(yīng)有采樣人簽章,并注明貼封日期,標(biāo)注放置方向。
3.5.3.4 堅(jiān)硬的外部包裝。外包裝在盛裝液體的情況下不得超過4 升,在固體物質(zhì)的情況下不得超過4 kg(不包括冰的重量)。樣品必須保持4 ℃溫度或更低溫度,并就近送動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)進(jìn)行保存。注意:切勿凍結(jié)全血或混合有血凝塊的血清。
外包裝標(biāo)簽和標(biāo)記:“B類感染物質(zhì)”標(biāo)簽,其正確的運(yùn)輸名稱旁邊標(biāo)注“B 類感染物質(zhì)”;采樣負(fù)責(zé)人的全名、地址和電話號(hào)碼;實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系人的全名、地址和電話號(hào)碼;標(biāo)簽上標(biāo)明“在4 ℃”、“在-20 ℃”或“在-80 ℃”保存。
3.6 廢棄物處理 采樣結(jié)束后,做好動(dòng)物尸體、場地、物品、個(gè)人防護(hù)用品的消毒和無害化處理。對(duì)不同場點(diǎn)盡量安排不同的采樣人員,避免交叉污染。
4.1 快速精準(zhǔn)檢測(表2)
表2 非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)
4.1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測 這是實(shí)驗(yàn)室快速檢測ASFV 的常用方法。大型養(yǎng)豬企業(yè)可建設(shè)ASFV 檢測實(shí)驗(yàn)室,當(dāng)豬場周邊和自己豬場受到威脅時(shí)做好疫情排查與監(jiān)測,為疫情處置和精準(zhǔn)清除提供技術(shù)支撐。開展qPCR 檢測必須配備專用的實(shí)時(shí)熒光PCR 儀和相應(yīng)檢測試劑。實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)開展ASFV 的qPCR 檢測。由于qPCR 檢測技術(shù)靈敏,極其微量的污染即可造成假陽性,對(duì)PCR 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分區(qū)管理可以避免檢測污染。應(yīng)根據(jù)條件將PCR 實(shí)驗(yàn)室分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、產(chǎn)物擴(kuò)增區(qū)等。
4.1.2 ASFV 抗體檢測 由于沒有疫苗,抗體的存在表明當(dāng)前或過去有感染。對(duì)于急性疾病的暴發(fā),病毒檢測(PCR)最有用,血清學(xué)診斷價(jià)值較低,因?yàn)榇蠖鄶?shù)豬在抗體反應(yīng)前死亡,在7~10 d內(nèi);但是如果存在幸存的豬只,特別是ASFV轉(zhuǎn)變?yōu)橹械榷玖蛘呷醵玖Χ局曛?,抗體檢測的作用凸顯。CISA-INIA 指出,在ASF 呈地方流行的區(qū)域,確診可疑病例最好用標(biāo)準(zhǔn)的血清學(xué)試驗(yàn)(ELISA),結(jié)合另一種血清學(xué)試驗(yàn)(IFA)或抗原檢測試驗(yàn)(FAT)。
抗體檢測的樣品類型:血清(避免溶血)、血漿、豬肉浸出液、組織滲出物、口腔液(取樣方便,無創(chuàng),但抗體水平低于血清)。建議在處理和檢測前加熱滅活血清中的ASF 病毒,OIE 推薦:56 ℃70 min或60 ℃20 min。
4.2 疫情確診 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心或省級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室可以按要求確診ASF疫情。
(全文完)