周 潔，黃 婧，孫體如，張 忠，曹 瑤

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153; 2.沭陽(yáng)縣生產(chǎn)力促進(jìn)中心，江蘇 沭陽(yáng) 223600)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndrews.)為芍藥科芍藥屬落葉小灌木，是我國(guó)的十大傳統(tǒng)名花之一。我國(guó)牡丹資源豐富，目前國(guó)內(nèi)外共有牡丹 1 100余品種。中國(guó)栽培牡丹主要有中原品種群、西北品種群、西南品種群、江南品種群以及國(guó)外品種群[1]，在品種資源、優(yōu)異性狀和花型齊備等方面，我國(guó)居世界首位?；ㄐ褪悄档ぷ钪匾挠^賞價(jià)值之一，牡丹的花型有2大類(單花類、臺(tái)閣花類)、4個(gè)亞類、13個(gè)類型[2]。牡丹千層類花型花瓣花芽分化的特點(diǎn)為花瓣向心式層層增加，樓子類花型分化特點(diǎn)為雄蕊離心式分化和瓣化，臺(tái)閣類花型為同一花原基上分化出上下2朵重疊的花器官。

花器官特征基因決定花原基形成不同的花器官，從而形成形態(tài)多樣的花。目前已確定4條開花調(diào)控途徑，即光周期途徑、 春化作用、 自主途徑、赤霉素(GA3)途徑[3]，通過(guò)調(diào)控植物開花時(shí)間的4條信號(hào)途徑激活一套開花途徑整合因子從而激活花分生組織特異基因啟動(dòng)開花。主要的開花途徑整合因子有CO (CONSTANS)、FLOWERING LOCUS T (FT)、LEAFY (LFY) 和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1)[4],SPL(squamosa promoter-binding protein-like)[5]，然后激活花分生組織特性基因如APETALA1/2 (AP1/2) 、FRUITFUL ( FUL )、SEEPALLATA4 (SEP4)等使莖端分生組織轉(zhuǎn)化為花序分生組織[6]。AP1/2屬A功能基因，決定萼片、花瓣特性, APETALA3(AP3)，TM6，PI屬B功能基因[7-8]，決定花瓣、雄蕊特性；AGAMOUS (AG)是唯一C功能基因，早期調(diào)控雌、雄蕊的發(fā)育，后期決定細(xì)胞分化；SHATTERPROOF(SHP)屬D功能基因，控制心皮發(fā)育；WUS為頂端分生組織特征基因，維持AG活性。

重瓣性是牡丹最要的觀賞價(jià)值之一，也是現(xiàn)代牡丹育種的重要目標(biāo)之一。重瓣牡丹品種已占據(jù)整個(gè)牡丹品種的80%以上。目前牡丹中與花器官發(fā)育的基因已有被分離和克隆，但是僅限于個(gè)別基因的克隆，關(guān)于牡丹花型調(diào)控的基因尚未系統(tǒng)研究。本研究利用Illumina HiSeq技術(shù)對(duì)牡丹2個(gè)不同花型的品種雌雄蕊正常的‘黑海撒金’和雌蕊瓣化的‘瓔珞寶珠’進(jìn)行測(cè)序，以期找到不同花型的差異表達(dá)基因，為花型的分子研究提供依據(jù)。研究牡丹花型調(diào)控的相關(guān)基因, 對(duì)深入了解牡丹花型發(fā)育機(jī)制具有重要理論意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)植物

本試驗(yàn)選用牡丹品種‘黑海撒金’(tree peony ‘HEIHAISAJIN’)和‘瓔珞寶珠’(‘YINGLUOBAOZHU’)總花瓣為材料，采集于江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院牡丹種質(zhì)資源圃，于4月待完全開花后采集2種牡丹的花瓣，每個(gè)品種采集3份，樣品迅速凍于液氮中，放于-80 ℃保存，備用。

1.2 轉(zhuǎn)錄組De novo測(cè)序

本研究利用無(wú)參轉(zhuǎn)錄組對(duì)‘黑海撒金’和‘瓔珞寶珠’的花瓣(各3份)進(jìn)行de novo測(cè)序，花瓣的總RNA采用TRIzol? Reagent(Invitrogen)提取后，利用Illumina Truseq TM RNA sample prep Kit方法構(gòu)建文庫(kù)，通過(guò)TBS380(Picogreen)定量后使用Illumina HiSeq進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除低質(zhì)量、接頭污染以及N比例超過(guò)10%的序列，使用的軟件為SeqPrep (https:∥github.com/jstjohn/SeqPrep), Sickle (https:∥github. com/najoshi/sickle)。將過(guò)濾后的干凈序列(clean reads)使用Trinity技術(shù)進(jìn)行de novo組裝，然后將組裝的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類去冗余，得到unigene。

1.3 功能注釋與差異表達(dá)基因的篩選

對(duì)拼接得到的unigene序列進(jìn)行注釋，并與數(shù)據(jù)庫(kù)NR，Swiss-Prot，KEGG和COG比對(duì)(E value<10-5)。對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量進(jìn)行樣本間的表達(dá)差異顯著性分析，找到相應(yīng)的差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)進(jìn)行可視化分析。差異表達(dá)基因的GO功能分析使用軟件Goatools (https:∥github.com/tanghaibao/GOatools) 進(jìn)行富集分析，使用方法為Fisher精確檢驗(yàn)，p值(p_fdr)≤0.05。差異表達(dá)基因的KEGG分析使用KOBAS( http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do ) 進(jìn)行KEGG PATHWAY富集分析，校正的p值(Corrected P-Value)以0.05為閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組序列測(cè)序和拼接

通過(guò)對(duì)‘黑海撒金’和‘瓔珞寶珠’2個(gè)品種6個(gè)樣本進(jìn)行RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾、去接頭、去冗余和低質(zhì)量序列后，獲得33 186 290到48 461 266條高質(zhì)量序列clean reads，Q20的比例為98.46%—98.6%，結(jié)果表明測(cè)序質(zhì)量較好(見表1)。通過(guò)trinity軟件(http:∥trinityrnaseq. sourceforge.net/)進(jìn)行de novo拼接，組裝后獲得49 191個(gè)unigenes，平均長(zhǎng)度為753 bp，最長(zhǎng)的為10 070 bp，N50為835 bp(見表2)。

表1 牡丹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝

表2 de novo序列拼接

2.2 unigenes功能注釋

如圖1所示，將拼接得到的unigenes進(jìn)行注釋，并與NR，GO，KEGG，SWSS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，其中比對(duì)到NR的unigenes為31 994，比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的為10 451個(gè)unigenes，比對(duì)到COG數(shù)據(jù)庫(kù)的為24 605個(gè)unigenes，比對(duì)到KEGG的為13 279的unigenes。這4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共有的基因?yàn)? 196個(gè)unigenes。

圖1 unigenes的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和注釋

2.3 差異表達(dá)基因DEGs的篩選

采用RPKM的方法，將差異表達(dá)基因定義為FDR<0.001,且倍數(shù)差異在2倍以上(|Log2 |Ratio|>1)的基因。以散點(diǎn)圖表示1個(gè)基因在2個(gè)轉(zhuǎn)錄本中的表達(dá)量，橫坐標(biāo)為在‘黑海撒金’的表達(dá)量，縱坐標(biāo)為在‘瓔珞寶珠’中的表達(dá)量(見圖2-a)；火山圖(Volcano-plots)為基因或轉(zhuǎn)錄本在2個(gè)樣本間表達(dá)差異的倍數(shù)變化值，橫坐標(biāo)為倍數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為P值的對(duì)數(shù)(見圖2-b)。通過(guò)‘黑海撒金’和‘瓔珞寶珠’2個(gè)轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)量差異的比較，共得到2 735 個(gè)差異表達(dá)基因，其中1 082個(gè)為上調(diào)基因，1 653個(gè)差異表達(dá)基因下調(diào)(如圖2)。

注：a散點(diǎn)圖；b 火山圖。黑為‘黑海撒金’，瓔為‘瓔珞寶珠’; Log2(FC)為‘黑海撒金’和‘瓔珞寶珠’的表達(dá)量比值的對(duì)數(shù)值。圖2 差異表達(dá)基因可視化分析

2.4 差異表達(dá)基因的注釋

將差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO 功能注釋，主要分布在25個(gè)功能區(qū)，在細(xì)胞組分中顯著富集的為90 S preribosome， 在分子功能中最顯著富集的為taxane 10-beta-hydroxylase activity，在生物學(xué)過(guò)程中最為顯著的是response to wounding。其中ribosomal subunit中富集的基因最多，有14個(gè)unigenes(見圖3-a)。對(duì)DEG進(jìn)行KEGG代謝通路的分析，顯著富集的通路有13條(P<0.05), 前5個(gè)富集的通路為Ribosome，Chemical carcinogenesis，Drug metabolism-cytochrome P450，Oxytocin signaling pathway，Tyrosine metabolism, 其中Ribosome最為顯著富集且基因最多，有36個(gè)(見圖3-b)。

注：a GO功能富集圖；b KEGG路徑富集圖圖3 DEGs的GO功能和KEGG路徑富集圖

2.5 候選功能基因的挖掘

如表3所示,對(duì)功能基因進(jìn)行挖掘，將得到的DEGs序列通過(guò)與NCBI進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與開花相關(guān)的功能基因有2個(gè)，為agamous-like MADS-box protein 65(AGL65)和floral homeotic protein APETALA 2(AP2)。AP2在‘黑海撒金’中幾乎無(wú)表達(dá)，在‘瓔珞寶珠’中表達(dá)量稍高。 AGL65在‘黑海撒金’中表達(dá)量稍高，在‘瓔珞寶珠’中幾乎無(wú)表達(dá)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了與性別決定相關(guān)控制雌雄發(fā)育的基因EMBRYO SAC DEVELOPMENT ARREST 3(EDA3), 該基因在‘黑海撒金’中表達(dá)量較高，而在‘瓔珞寶珠’中幾乎無(wú)表達(dá)。說(shuō)明在牡丹中雌蕊的瓣化由開花基因和性別決定基因共同調(diào)控。

表3 功能基因的篩選

3 結(jié)論與討論

目前從牡丹萼片、花瓣、雄蕊和心皮中已分離出很多關(guān)于花發(fā)育的相關(guān)基因。其中與ABCDE模型相關(guān)的基因有PsAP1，PsAP2，PsPI，PsMADS1，PsMADS9，PsAG和PsMADS5等[9]。MADS-box基因作為參與花器官發(fā)育的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，在生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)、開花調(diào)節(jié)和器官發(fā)育方面也發(fā)揮著重要的作用[10-11]。AP2屬于A類基因，主要負(fù)責(zé)萼片和花瓣的形成[12]。本研究中AP2基因在‘黑海撒金’中幾乎無(wú)表達(dá)，在‘瓔珞寶珠’中表達(dá)量稍高，說(shuō)明AP2參與了雌蕊瓣化的過(guò)程，負(fù)責(zé)花瓣的形成，與ABCDE模型的理論一致。AGL6基因已在柳杉[13]、買麻藤[14]、春蘭[15]等植物中分離得到。水稻AGL6同源基因OsMADS6在雌蕊與分生組織中表達(dá)[16]。臘梅CpAGL6可能具有調(diào)控開花時(shí)間與花器官形成的雙重功能[17]。牡丹中PsAGL6在薔薇型牡丹中的表達(dá)量較高，在萼片、花瓣和雌蕊顯著表達(dá)[18]。而在本研究中AGL65在‘黑海撒金’中表達(dá)量稍高，在‘瓔珞寶珠’中幾乎無(wú)表達(dá)。說(shuō)明AGL65參與了雌蕊的分化和發(fā)育，而在雌蕊瓣化的花型中無(wú)表達(dá)，且AGL65與AGL6功能存在差異，AGL65成員目前在功能方面還沒(méi)有報(bào)道，所以AGL65可能是新的調(diào)節(jié)雌蕊瓣化發(fā)育的基因成員，屬于C類基因。EMBRYO SAC DEVELOPMENT ARREST 3 (EDA3)參與胚囊的分化, 且僅在子房中表達(dá)，且EDA3能促進(jìn)胚珠的發(fā)育[19]。EDA3也僅在‘黑海撒金’中表達(dá)，表達(dá)量為7倍，所以這一結(jié)果也與報(bào)道的功能一致。所以可以推測(cè)EDA3為D類基因，調(diào)控胚珠的發(fā)育。綜上所述，牡丹花型雌蕊的瓣化不僅有ABCDE開花模型A類基因AP2促進(jìn)了花瓣的形成，C類基因AGL65調(diào)控雌蕊的發(fā)育，也可能由D類基因EDA3作用于胚珠，調(diào)控雌蕊的發(fā)育。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究了不同花型牡丹的差異表達(dá)基因，篩選出了調(diào)控牡丹花發(fā)育的新成員基因AGL65，AP2和EDA3，這些基因的挖掘?yàn)槟档せㄆ鞴俚难芯堪档ご迫锇l(fā)育和瓣化、胚珠發(fā)育的研究提供了很好的理論基礎(chǔ)。